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昆虫病原真菌是一类重要的,广泛分布的生防微生物,调控着生态系统中昆虫种群的数量和密度,在自然界中扮演重要的角色。昆虫病原真菌作为杀虫微生物农药,具有对环境安全、人畜无害等优点,被认为是替代化学农药的理想产品,但其致死时间长、生产成本高、对环境敏感等缺点限制了昆虫病原真菌的大规模应用。因此研究昆虫病原真菌的侵染致病、产孢和抗逆境机制对生物防治具有十分重要的意义。昆虫病原真菌在自然界中广泛分布,从北极到热带,从高原到平原,从沼泽到沙漠均有分布,因此其必然面临各种各样的环境压力如高渗、温度、紫外、氧等。乙醇脱氢酶在动物、植物、真菌、细菌中广泛存在,转录组分析表明乙醇脱氢酶1（MaADH1）在蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）产孢时期高表达,表达模式分析表明MaADH1在产孢时期高表达,而在其他时期表达量很低或不表达。因此采用基因敲除的方法对MaADH1基因在蝗绿僵菌中的功能及其启动子的结构与功能进行了分析。主要研究结果如下:1.MaADH1的克隆及功能分析1.1 MaADH1的克隆与序列分析根据已知的蝗绿僵菌全基因组序列和cDNA序列,克隆得到了MaADH1序列,其登录号为XM007811707.1。分析得知MaADH1序列全长为1131 bp,MaADH1cDNA ORF全长为1059 bp,编码353个氨基酸,其中包含一个内含子长度为69 bp;保守结构域分析表明MaADH1含有3个典型的结构域即锌指结构、NADP结合位点、底物催化活性位点,具有ADH1的结构特征。1.2 MaADH1敲除和回复载体的构建及验证为了分析MaADH1基因的功能,采用基因重组的方法构建了ADH1敲除和回复载体,并转化绿僵菌,通过PCR筛选MaADH1敲除菌株和回复菌株并Southern杂交验证各转化子的正确性。最终获得正确的MaADH1敲除菌株和回复菌株。1.3 MaADH1基因表达模式分析半定量PCR和RT-PCR分析结果表明MaADH1在产孢时期高表达,而在菌丝,附着胞和虫菌体时期表达量较低。1.4低氧条件下MaADH1基因对蝗绿僵菌生物量的影响在低氧条件下,ΔMaADH1的生物量显著低于WT和CP,其生物量仅为WT和CP菌株的50%,在正常条件下,ΔMaADH1的生物量与WT和CP相比无显著差异。1.5低氧条件下maadh1调控绿僵菌产孢在低氧条件下对绿僵菌在固体大米和液体1/4sday培养基中的产孢量进行了分析。结果表明无论是固体发酵还是液体发酵Δmaadh1菌株的产孢量均显著低于wt和cp;在固体发酵中,Δmaadh1在低氧条件下产孢量仅为正常条件下的48%,在固体发酵中Δmaadh1产孢量较低,主要以菌丝形式存在。1.6低氧条件下maadh1基因的表达量及溶氧量分析在低氧条件下,Δmaadh1菌株所在液体培养基中的溶氧量与wt和cp相比无显著差异;rt-pcr分析结果表明在低氧条件下maadh1基因的表达量显著高于正常溶氧条件下maadh1基因的表达量。1.7低氧条件下maadh1酶比活性测定通过酶学活性分析表明,在低氧条件下乙醇脱氢酶1的活性显著高于正常溶氧条件下乙醇脱氢酶1的活性,其结果与rt-pcr结果一致。1.8低氧条件下培养基中乙醇和乙醛含量测定及耐受性分析在低氧条件下分析了wt、Δmaadh1和cp菌株在液体培养基中乙醇和乙醛含量的动态变化。结果表明在低氧条件下随着时间的延长,乙醇和乙醛含量逐渐增多,但Δmaadh1中乙醇含量显著低于wt和cp,然而Δmaadh1中乙醛含量显著高于wt和cp;耐受性分析表明wt,Δmaadh1,和cp菌株对乙醛的耐受性显著低于对乙醇的耐受性。1.9乙醛影响菌丝的生长和产孢为了分析乙醛对绿僵菌生长和产孢的影响,在培养基中加入不同浓度的乙醛,结果表明当培养基中乙醛含量达到0.01%浓度时就能抑制绿僵菌的生长和产孢,并且Δmaadh1菌株的生长和产孢量显著低于wt和cp。2.pmaadh1的结构与功能研究2.1pmaadh1生物信息学分析结果根据adh1基因在蝗绿僵菌基因中的位置,克隆maadh1上游3246bp的序列,命名为pmaadh1。并对其进行生物信息学分析,结果表明起始密码子上游163bp为转录起始位点;pmaadh1含有一些保守的调节元件,如tata-box,caat-box和ct富集区;maadh1的上游区域内存在一些adh1启动子的保守序列。在pmaadh1保守序列及其它区域存在大量正、反向重复序列。2.2转化子验证结果根据pmaadh1功能元件的位置,克隆不同长度（3246bp,2702bp,2448bp,2219bp,1670bp,1138bp,521bp,226bp）的pmaadh15’缺失片段,与egfp基因片段融合插入pk2-sur载体,并共培养转化绿僵菌。对初筛转化子进行pcr和Southern blot验证,Southern blot结果表明,转化子中PMaADH1的拷贝数为1到2个,大部分为单拷贝。2.3 PMaADH1缺失突变分析qRT-PCR分析结果表明缺失了-3246 bp至-2702 bp区域的Del1对EGFP的启动活性没有显著影响,表明该区域对启动子来说不是必需的;而进一步缺失-2702bp到-2448 bp区域的Del2启动子活性显著增强,增强了约20%,说明在此区域存在反式作用元件;而当缺失-2448 bp到-2219区域的Del3启动子的活性下调了15%,说明该区域存在重要的顺式作用元件;缺失-2219 bp到-1690 bp区域的Del4,启动子活性增强了15%说明在此区域存在反式作用元件;当缺失了-1690 bp到-1138bp区域的Del5启动子活性下降了20%,表明该区域存在重要的顺式作用元件,但当缺失-1138 bp到-521 bp区域时,Del6的活性下降了99.7%,说明此区域对启动子的活性是至关重要的;缺失-521 bp到-226 bp区域即Del7基本检测不到信号。2.4 PMaADH1特异表达Mcl1显著提高蝗绿僵菌毒力用活性较强的Del3启动子特异表达胶原蛋白（Mcl1）,体内注射实验结果表明与WT相比转化子毒力显著增强,LT50提前0.8天。综上所述,在低氧条件下MaADH1通过乙醛代谢来调控蝗绿僵菌的生长和产孢,MaADH1基因在孢子时期特异高表达,启动子结构与功能研究表明MaADH1基因启动子存在重要的氧压力应答元件并具有构建工程菌株的潜力。