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糖苷内切酶S(EndoS,EC 3.2.1.96)是一种来源于化脓链球菌的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶,其能够特异性地水解人源IgG抗体Fc片段上的N-糖链。近年来,基于野生型EndoS定点突变的酶工程研究报道了两种新的具有糖苷转移酶活性的突变体(EndoS D233A和D233Q),其能够将噁唑啉活化的人工改造的复杂糖型N-糖链连接至去糖基化的IgG抗体Fc片段上。由此,结合EndoS的糖苷内切酶活性和其突变体的糖苷转移酶活性发展出了一种对抗体Fc糖链进行体外改造的新型化学酶法策略。该策略被广泛应用于抗体生理功能及抗体免疫治疗等相关研究,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)。因此,EndoS及其糖苷转移酶突变体是抗体修饰和改造研究中非常有效的工具酶,其在基于生物催化的工业制药领域具有重要的应用价值。然而,目前对EndoS及其糖苷转移酶突变体在工业应用方面的研究仍然存在很多亟需解决的关键问题。首先,EndoS及其糖苷转移酶突变体在大肠杆菌中重组表达的产量较低,无法满足工业应用需求且使用成本高。其次,目前EndoS及其糖苷转移酶突变体主要以游离酶的形式应用于IgG抗体N-糖链生物催化改造,导致下游产物分离步骤繁琐,同时游离酶无法回收重复利用,限制了其在工业领域中的有效应用。因此,发展EndoS及其突变体酶固定化技术是解决上述弊端的有效途径,对提高其工业应用价值具有重要意义。本论文成功建立了一种一步固定纯化法固定融合酶CBD-EndoS及其突变体的策略,并利用固定化酶在体外实现了抗体Fc片段糖基化改造。首先,我们将糖苷内切酶(EndoS及其糖苷转移酶突变体D233A,D233Q)基因序列与pET-35b载体上的CBD标签序列相融合并导入大肠杆菌。然后我们通过一步固定纯化策略将融合表达的CBD-EndoS及其突变体高效地结合至微晶纤维素上,其固定化效率达到81%以上。其次,我们发现固定化的CBD-EndoS及其突变体表现出较高的生物催化活性,并利用固定化酶成功改造了一种治疗性抗体的Fc片段N-糖链。最后,我们初步分析了固定化CBD-EndoS及其突变体的重复利用稳定性和储存稳定性。固定化CBD-EndoS及其突变体在重复使用5次后保留80%以上的初始酶活,在4℃储存30 d后保留85%以上的初始酶活。