论文部分内容阅读
前言乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈不断上升趋势。钾通道电流(IK)在肿瘤细胞中的生物物理特性及其在肿瘤细胞生长中的调控作用已经被广泛研究。研究发现,IK在肿瘤细胞增殖中具有促进作用,促进IK传导的各种因子如缬氨霉素、泌乳素、胎牛血清等可刺激肿瘤细胞增殖;IK阻断剂如四乙胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)等既能抑制各种肿瘤细胞中的IK,又能抑制这些细胞的增殖。钾离子通道作为肿瘤细胞增殖关键调控物观点,近来已经被许多实验及临床证据所认同。钾离子通道活性的增加与增殖速率的提高有关,但是,钾离子通道调控肿瘤细胞增殖的机制尚不甚明了。抗肿瘤药多西紫杉醇(docetaxel,DOC)是由植物Taxus baccata针叶中提取巴卡丁(baccatin)经半合成改造而成,其基本结构类似紫杉醇,但水溶性较高。其为细胞有丝分裂抑制剂,通过促进小管聚合成稳定的微管抑制其解聚,使游离小管的数量明显减少而影响细胞的有丝分裂,导致细胞周期的变化,从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用。目的1、DOC、非选择性钾离子通道阻断剂4-AP及DOC与4-AP联合应用对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响。2、明确非选择性钾离子通道阻断剂4-AP对DOC抗人乳腺癌细胞MDA-MB-435S作用的影响机制,为开发一种多靶点治疗乳腺癌方案提供理论依据。方法1、MTT比色法检测药物对MDA-MB-435S细胞增殖的影响:取对数生长期细胞接种孵育,药物处理24、48、72 h后,每孔加5μg·gL-1的MTT 10μl,37℃继续培养4 h后弃液,每孔加DMSO 100μl,60 rpm振荡10 min,ELx800通用型酶标仪于570 nm处测OD值,并计算增殖抑制率。抑制率计算如下:抑制率(%)=(对照孔OD均值-实验孔OD均值)/对照孔OD均值×100%。2、流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测药物对MDA-MB-435S细胞凋亡的影响:取对数生长期细胞接种,药物处理24 h后收集细胞,1000 rpm离心10 min,弃上清,加入103μl冰冷的PBS使细胞悬浮,重复以上步骤两次,然后将细胞重悬于200μl Binding Buffer中,加入10μl Annexin V-FITC和5μlPI混匀,室温避光反应15 min,加入300μl Binding Buffer混匀,1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡。3、流式细胞术PI单染法检测药物对MDA-MB-435S细胞周期的影响:取对数生长期细胞接种,药物处理24 h后收集细胞,1000 rpm离心5 min,弃上清,加入103μl冰冷的PBS使细胞悬浮,重复以上步骤3次后缓缓加入103μl冰冷的75%乙醇,4℃过夜,次日,1500 rpm离心10 min,小心弃上清后加入103μl冰冷的PBS使细胞悬浮,1500 rpm离心5 min后小心弃上清,加入0.1μg·μL-1PI和0.1μg·μL-1 Rnase A各500μl,37℃培养40 min后流式细胞仪检测细胞周期。实验结果1、DOC、4-AP单独应用均能抑制MDA-MB-435S的增殖;5×103μmol·L-1的4-AP合用25μmol·L-1的DOC对MDA-MB-435S达最大抑制率的时间明显缩短,由72 h缩短到24 h;DOC和4-AP对MDA-MB-435S的增殖抑制有相加作用,并呈剂量-时间依赖性(P<0.05)。2、2μmol·L-1和5μmol·L-1的DOC单独作用24 h,MDA-MB-435S产生细胞凋亡并不明显,当与5×103μmol·L-1的4-AP联合应用后,细胞凋亡和死亡明显增加,晚期凋亡和死亡细胞由对照组的6.99%±1.15%增加到2μmol·L-1DOC+5×103μmol·L-14-AP组的20.67%±0.91%和5μmol·L-1DOC+5×103μmol·L-14-AP组的11.98%±0.93%,这种变化随DOC剂量的增加而愈加明显(P<0.05)。3、单独应用DOC可使MDA-MB-435S阻断在G2/M期,细胞比率由对照组的7.41%±2.89%增加到2μmol·L-1 DOC组的30.73%±1.69%和5μmol·L-1DOC组的76.26%±0.84%;单独应用4-AP可使MDA-MB-435S阻断在G0/G1期,细胞比率由对照组的70.79%±0.62%增加到5×103μmol·L-14-AP组的75.73%±0.40%;两药联合应用可使MDA-MB-435S阻断在G2/M期,2μmol·L-1 DOC+5×103μmol·L-1 4-AP组的细胞比率为25.86%±0.92%,5μmol·L-1 DOC+5×103μmol·L-1 4-AP组的细胞比率为40.02%±1.67%,这种变化随DOC剂量的增加而愈加明显(P<0.05)。结论1、DOC抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435S在G2/M期的增殖,可剂量依赖性诱导MDA-MB-435S细胞凋亡;2、4-AP抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435S在G0/G1期的增殖,促进DOC诱导MDA-MB-435S细胞凋亡和细胞死亡。