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安莎霉素(ansamycins)是一类以3-amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA)为独特起始单元的Ⅰ型聚酮,通常具有良好的生物活性,如利福霉素(rifamycins)是目前临床上使用的抗结核药物、格尔德霉素(geldanamycin)和美登木素(maytansine)为抗肿瘤药物。安莎三烯(ansatrienins)有抗真菌和酵母的活性,但其生物合成研究一直进展缓慢,2011年刘文课题组通过差异转录组学研究克隆了安莎三烯生物合成的完整基因簇,生物信息学分析推测O-(N-环己甲酰)-D-丙氨酰基侧链的加载由单模块非核糖体肽合成酶MycC.酯酶基因mycF4和N-酰基转移酶MycF1负责完成,但没有实验证据。本学位论文以链霉菌XZQH13菌株为研究材料,聚焦安莎三烯独特侧链的加载,通过体内体外实验对单模块非核糖体肽合成酶AstC和N-酰基转移酶AstF1的催化机制进行了解析。Streptomyces sp. XZQH13菌株是厦门大学生命科学学院微生物药物课题组从青海土壤中分离获得的一株AHBA合酶基因阳性菌,通过基因序列分析推测其安莎基因簇ast编码安莎三烯生物合成的Ⅰ型聚酮合酶及其后修饰酶。本课题组谢超同学通过组成型表达正调控因子astGl,成功激活该基因簇,显著提高了安莎三烯的产量；邓晶晶同学从该突变株的发酵产物中分离鉴定了2个已知安莎三烯hydroxymycotrienin A (1)和thiazinotrienomycin G (2)。在此基础上,我们通过序列分析,预测该基因簇中的astC和astF1基因可能编码O-(N-环己甲酰)-D-丙氨酰基侧链加载的相关酶。为了验证这一预测,我们分别敲除了astC和astF1基因,突变株发酵产物的HPLC分析结果显示这两个基因敲除后都终止了化合物1和2的合成,同时积累了多个具有安莎三烯骨架特征紫外吸收的差异峰；通过对astC基因敲除突变株发酵产物的HPLC-DAD追踪分离,邓晶晶同学鉴定了化合物1和2的生物合成前体thiazinotrienomycinol (3)(安莎三烯醇),其C11位没有(N-环己甲酰)-D-丙氨酰基侧链,表明AstC可能参与11-O-丙氨酸酯键的形成。为了验证AstC和AstF1的功能,我们对这两个蛋白进行了异源表达、纯化和体外表征。AstC为单模块NRPS样蛋白,含有A-PCP-TE三结构域,可以催化前体thiazinotrienomycinol(3)的D-丙氨酰化,其最适pH为8.O,最适温度为30℃。在D-Ala浓度一定条件下,AstC催化前体thiazinotrienomycinol(3)的Km值为40.21±20.601μM,Kcat为0.70±0.20 min-1; thiazinotrienomycinol(3)浓度一定的条件下,AstC催化D-丙氨酸的Km值为5.57±1.56 μM,Kcat为0.27+0.03 min-1。此外,我们还对AstC的氨基酸底物特异性进行了考察,结果显示,尽管已知的安莎三烯类化合物C-11位均为D-丙氨酰基,但AstC在体外除了使用D-Ala为底物外,还可以加载D-缬氨酰基、β-丙氨酰基、D-丝氨酰基、D-苏氨酰基和甘氨酰基五种氨基酸。AstF1为N-酰基转移酶,尽管我们未能在其敲除突变株中分离得到相应的前体,但在体外实验中,它能以环己甲酰-SNAC为酰基供体,将环己甲酰基转移至11-O-D-丙氨酰安莎三烯醇的丙氨酰基N上,证实了其在安莎三烯侧链加载中的功能；鉴于安莎三烯的结构多样性主要取决于其丙氨酰基N上酰基的多样性,我们还使用了另外五种酰基-SNAC供体进行体外N-酰基转移反应,LC-MS检测结果显示它们均可以被AstF1有效加载,表明AstF1有较强的酰基底物广谱性。本论文在理论预测的基础上,通过基因敲除和异源表达蛋白的体外活性表征,阐明了AstC和AstF1加载安莎三烯独特的O-(N-环己甲酰)-D-丙氨酰基侧链的功能,首次发现单模块非核糖体肽合成酶AstC可以催化D-丙氨酸酯的形成。另外,对AstC和AstF1的底物广谱性的了解,为通过合成生物学途径合成新安莎(三烯)提供了参考。