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艰难梭菌(Clostridium difficile),革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌,是抗生素引起的感染型腹泻的主要原因之一。当肠道微生物菌群平衡被扰乱,艰难梭菌大量繁殖,过度生长,成为肠道的主要菌群,即会引发艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI),导致肠表皮细胞黏膜坏死和肠上皮细胞凋亡,黏膜通透性增加,最终造成严重腹泻和肠道炎症发生。近年来,由于抗生素严重滥用,艰难梭菌感染在全球范围内的发病率、死亡率逐年升高,未来将成为威胁公众安全的流行疾病之一。研究表明艰难梭菌分泌的两种外毒素(Tcd A和Tcd B)是CDI发病的主要诱因。本课题以抗Tcd A的纳米抗体AA6和抗Tcd B的纳米抗体E3为基础,通过基因工程手段将AA6与E3融合,以提高纳米抗体的稳定性和亲和力;通过乳酸乳球菌表达目的蛋白,优化蛋白表达技术;通过体外细胞实验检测研究重组纳米抗体E3-AA6对Tcd A和Tcd B的抑制作用。此项研究将对CDI的预防、控制及治疗提供一个新途径。具体研究如下:1、在巨大芽孢杆菌(B.megaterium)中表达毒素Tcd A、Tcd B。首先将p His1525-Tcd A、p His1525-Tcd B质粒分别转化到B.megaterium感受态细胞中,筛选出阳性重组菌株,使用诱导剂木糖对其进行诱导表达,利用镍亲和层析对重组蛋白Tcd A、Tcd B进行分离纯化,表达纯度分别为86%和82%。通过细胞变圆实验以及流式细胞技术鉴定所表达毒素的生物活性,在细胞变圆实验中,5μg/m L的Tcd A在能够引起HCT-8细胞100%变圆,0.4 ng/m L的Tcd B在能够引起HCT-8细胞100%变圆。通过流式细胞凋亡实验显示Tcd A、Tcd B在6 h就可以引起HCT-8细胞的明显凋亡。2、构建纳米抗体乳酸乳球菌通过分步PCR方式,构建表达载体p NZ8148-E3-AA6。载体电转化到乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,命名为p NZ8148-E3-AA6/NZ9000。使用诱导剂nisin对其进行诱导表达,利用镍亲和层析对重组蛋白E3-AA6进行分离纯化,纯度达到95.2%,MTT检测其具有良好的生物活性。3、纳米抗体E3-AA6对毒素Tcd A、Tcd B的抑制效果分析。通过Woundhealing法分析HCT-8细胞的迁移能力变化,探究E3-AA6对Tcd A、Tcd B的病理作用抑制效果;通过CCK8法分析HCT-8细胞的活性变化情况,探究E3-AA6对Tcd A、Tcd B的毒性作用抑制效果。实验结果表明:50μg/m L的E3-AA6对Tcd A、Tcd B细胞病理作用的相对抑制率分别为23%和41.7%;对Tcd A、Tcd B细胞毒性作用的相对抑制率分别为21.1%和39%。这为治疗艰难梭菌引发的感染提供了新的治疗途径以及口服药物的开发和应用提供了实验基础。