论文部分内容阅读
谷氨酸棒杆菌作为一种重要的工业微生物,其在进行微生物发酵过程中,不可避免地会受到来自发酵环境的各种胁迫,进而对其发酵能力和产物产生不良影响。环境胁迫会通过提高胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的水平来打破原有的氧化还原稳态,从而对生物大分子造成损伤最终导致细胞死亡。因此增强谷氨酸棒杆菌在不良环境下的耐受性和鲁棒性已成为提高其工业发酵能力的关键措施。为应对氧化胁迫压力微生物已进化出两套抗氧化防御系统:非酶和酶系统,后者主要包括触酶(Cat)、超氧化物歧化酶(SOD)、硫氧还原蛋白(Trx)、分枝硫醇二硫还原酶(Mtr)等。其中,Mtr是催化氧化态分枝硫醇(MSSM)为还原态分枝硫醇(MSH)的关键酶,在维持细胞的氧化还原态平衡和抗氧酶活性中起关键作用。然而目前关于谷氨酸棒杆菌中Mtr的生理生化功能的研究甚少,谷氨酸棒杆菌中MSH的生理功能更是无人问津。因而,在本研究中,我们以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的Mtr为研究目标,发现了Mtr内在生理功能以及其发挥这些功能的生化机理,详细论文结果如下:1.本研究在构建Mtr突变株时,进行了8000个双交换目的菌株的筛选之后,发现最终筛选过程双交换目的菌株都会恢复至野生型,因此得出Mtr在C.glutamicum中是必需的基因。2.在构建了Mtr过表达菌株WT(pXMJ19-His6-mtr)的基础上,测定了过表达菌株与野生型菌株WT(pXMJ19)在能诱导胞内产生ROS的不同氧化剂,烷化剂,抗生素和重金属等胁迫剂处理下的存活率,结果表明,过表达Mtr能明显增强C.glutamicum的抗环境胁迫能力,揭示了Mtr在C.glutamicum中的生理功能。3.通过比较过表达Mtr菌株与野生型菌株在不同胁迫剂处理下胞内的ROS水平及蛋白质的羰基化水平,本研究发现过表达Mtr能明显降低处于氧化应激状态下的胞内ROS水平,并且降低胞内蛋白质羰基化水平。4.通过比较WT(pXMJ19-His6-mtr)和WT(pXMJ19)在不同胁迫条件下胞内蛋白质可逆硫醇化修饰水平和MSH:MSSM比例,发现过表达Mtr能明显增加胞内蛋白质的可逆硫醇化修饰水平和提高MSH:MSSM比例,进而在逆境条件下对蛋白质进行保护、维持胞内较高的MSH水平及合适的氧化还原环境。5.通过比较WT(pXMJ19-His6-mtr)和WT(pXMJ19)在不同胁迫条件下,胞内某些抗氧酶的活性及表达水平,本论文发现过表达Mtr会增强胞内某些抗氧酶的活性并上调这些抗氧酶的表达,进而增强C.glutamicum的鲁棒性。6.β-半乳糖苷酶活性和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验,发现Mtr的表达受到ROS的诱导并且受SigH蛋白的正调控,凝胶阻滞迁移实验(EMSA)证明SigH可直接的、特异的结合到mtr启动子区域对其进行转录水平调控。综上所述,本研究发现C.glutamicum中Mtr具有抗环境胁迫的生理功能,而发挥其生理功能的内在机制,主要是通过直接或间接的清除过多ROS,增强胞内抗氧酶活性及表达水平,增加胞内蛋白质可逆硫醇化修饰以及维持较高MSH:MSSM比例等方式实现的。这对于增强谷氨酸棒杆菌在复杂发酵环境中的鲁棒性具有重要意义。