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梨火疫病（Fire blight）是由噬淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的一类具有毁灭性的植物病害,主要侵染仁果类果树,是我国重要的进境检疫对象。自上世纪中叶以来,全球每年都有一到两个国家报告发生梨火疫病,目前,这种病害已经传播到了中亚、东亚地区,对我国苹果和梨产业的健康发展构成潜在的威胁。因此,有必要建立准确、快速、灵敏的检测方法,有效防范梨火疫病菌传入我国。病原菌为了将其编码蛋白质分泌到胞外,演化出多种分泌途径,其中Sec依赖的分泌机制在细菌中广泛存在,是细菌蛋白跨膜运输的主要途径。然而,目前为止从梨火疫病菌中鉴定出的分泌蛋白几乎仅限于III型效应蛋白,关于Sec依赖的分泌蛋白尚未见报道。本论文针对梨火疫病菌Sec依赖性分泌蛋白酶和纤维素酶开展了研究,同时选取Sec依赖分泌蛋白EAMY3046进行了原核表达和纯化,主要结果如下:1.通过生物信息学分析发现,梨火疫病菌含有Sec分泌系统的所有核心组分,表明该病菌具有Sec依赖的分泌能力。2.利用生物信息学技术结合PhoA检测体系,在梨火疫病菌全基因组水平上筛选、鉴定了15个Sec依赖分泌的蛋白酶,分别命名为EaPrt1-15。其中,EaPrt1、2、5、6、7、8、9、10、13和15为丝氨酸蛋白酶,EaPrt3和11为半胱氨酸蛋白酶,EaPrt4、12和14为金属蛋白酶。接种梨幼果,分别于接种后0 h、8 h和24 h收集样品,提取总RNA,利用RT-qPCR分析15个Sec依赖性分泌蛋白酶编码基因的转录表达,结果显示EaPrt4、5、8、14和15呈现稳定增加的基因表达模式,EaPrt6、11和13的表达水平持续下降,而EaPrt1、2、3、7、9、10和12在8 h达到高峰,但在24 h下降,显示出一种“先升后降”的表达模式。其中,EaPrt7在所有被测基因中的变化最为显著,与0 h时的表达水平相比,其在8 h的表达量增加37倍,而在24 h仅增加6倍。这一结果暗示梨火疫病菌可能利用Sec系统分泌一系列蛋白酶,促进病原菌侵染寄主植物。3.利用生物信息学技术结合PhoA检测体系,在梨火疫病菌全基因组序列中发掘鉴定了2个Sec途径依赖分泌的纤维素酶:EAMY3602和EAMY1236。其中,前者为内切葡聚糖酶,后者为β-葡萄糖苷酶。接种梨幼果,利用RT-qPCR分析Sec依赖性分泌纤维素酶编码基因的转录表达,结果显示EAMY3602编码基因（Ea3602）在8 h和24 h的mRNA表达量逐渐降低,但与0 hpi相比无显著差异;相反,EAMY1236编码基因（Ea1236）在8 h和24 h的mRNA表达量逐步提高,较0 h分别提高2.43倍和3.26倍,差异显著。这些数据暗示Sec依赖分泌的内切葡聚糖酶EAMY3602可能与梨火疫病菌侵染无关,而β-葡萄糖苷酶EAMY1236可能是梨火疫病菌的毒力因子,在侵染寄主植物过程中发挥重要作用。4.采用分子生物学方法,从梨火疫菌株DSM 17948克隆了EAMY 3046蛋白的编码基因Ea3046。利用生物信息学与PhoA检测体系,明确EAMY 3046蛋白具有Sec依赖分泌特性。接种梨幼果,利用RT-qPCR分析Ea3046的转录表达,结果显示该基因在梨火疫病菌侵染寄主植物过程中的表达量显著上升。此外,基于pET-30a构建原核表达载体pET-mEa3046,导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导16h后,结果表明mEa3046在15℃条件下的表达量高于其在37℃的表达量,且以包涵体形式存在;利用Ni-IDA亲和层析纯化目标蛋白,经SDS-PAGE分析表明mEa3046蛋白纯化成功。综上所述,本论文筛选了梨火疫病菌Sec依赖性分泌蛋白酶和纤维素酶,分析了其在转录水平上的基因表达模式,同时针对Sec依赖分泌蛋白EAMY3046开展了原核表达和纯化的研究,为揭示梨火疫病菌致病新机制及制备抗体用于检疫检测奠定了基础。