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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在现代工业生物技术领域具有广泛的应用价值。真菌相互作用可以促进漆酶合成菌大量合成漆酶。研究相互作用过程中漆酶上调表达机制,可以为通过微生物相互作用途径生产漆酶提供理论依据,同时也可以为真菌间相互作用研究提供借鉴。然而,真菌相互作用诱导漆酶上调表达的机制目前尚不清楚。本文以模式真菌灰盖鬼伞菌Coprinopsis cinerea strain Okayama7(#130)为漆酶分泌菌,通过筛选、优化建立真菌相互作用诱导漆酶合成研究体系,并以此为基础,在生理生化水平及全RNA水平研究探讨了相互作用诱导漆酶合成可能的表达机制,获得的主要研究结果如下:
1.以模式菌株C.cinerea为漆酶合成菌,通过功能平板对峙培养,从候选相互作用真菌中筛选得到诱导菌Gongronella sp.w5;以碳源、氮源、接种量等为影响因素,漆酶活力为考察指标,对相互作用诱导漆酶合成的液态发酵培养基进行了优化。结果显示,以蔗糖为碳源、DL-天冬酰胺为氮源、Gongronella sp.w5接种量为2.5%(v/v)时,相互作用体系中漆酶活力最高,达到1800 U/L,是C.cinerea纯培养体系中漆酶活力(2 U/L)的900倍,而Gongronella sp.w5纯培养无漆酶合成;相互作用体系与化学诱导纯培养体系中漆酶同工酶谱存在差异,表明两种方式中漆酶表达机制存在差异。
2.通过系列摇瓶发酵实验考查了菌丝体的物理接触、可溶性次级代谢产物、碳源代谢等因素对漆酶合成的影响。结果显示,Gongronella sp.w5与C.cinerea之间菌丝的直接接触对漆酶基因上调表达无显著影响;可溶性的化学分子可能是诱导漆酶基因上调表达的主要原因;然而,活性分子的漆酶诱导活性必须依赖于Gongronella sp。w5的存在,因为在纯培养体系中,C.cinerea无法代谢利用蔗糖,菌丝细胞处于休眠状态。在相互作用体系中,Gongronella sp.w5是蔗糖的分解者,其分解蔗糖生成果糖和葡萄糖,供C.cinerea竞争利用,从而改变C.cinerea的基因表达模式,使菌丝细胞处于活跃状态,表现为生物量的增加等,为漆酶合成提供基础。
3.通过透析袋隔离培养实验成功模拟了相互作用环境,并克服真菌相互作用研究过程中菌丝体相互缠绕、无法获得单一菌丝体的瓶颈,制备获得C.cinerea菌丝体;构建C.cinerea基因表达谱文库并进行数字化基因表达谱测序。结果分析显示,Gongronella sp.w5与C.cinerea相互作用合成漆酶的过程中,C.cinerea基因组中参与碳源代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、异生化合物代谢途径的基因发生大量差异表达,为生理生化水平上获得的漆酶上调表达机制提供了分子水平的证据,同时提示相互作用体系中金属离子在漆酶基因上调表达中可能发挥作用,为下一步深入的机制研究奠定基础。而且,本实验结果为微生物间攻击与防御等行为研究提供了借鉴。