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本课题构建了CEA启动子正调控IL-15基因表达质粒载体,体外分别转染CEA阳性结肠癌细胞系S W480细胞和CEA阴性乳腺癌细胞系MCF-7细胞,证实CEA启动子正调控IL-15基因表达质粒载体能在CEA阳性细胞内高效地、特异性表达,在CEA阴性细胞中低表达,实现了质粒载体靶向性表达的目的,为下一步体内实验研究,乃至进一步开发以IL-15为基础的肿瘤免疫基因治疗方案奠定基础。第一部分CEA启动子正调控IL-15基因表达质粒载体的构建目的:构建CEA启动子正调控IL-15表达质粒载体,并为下一步体外细胞转染实验做准备。方法:①构建CMV启动子正调控基因表达质粒载体:利用基因克隆技术,将IL-15(LSP-IL-15)的编码基因克隆于空质粒pHi2-MCS-CMV-TAT(M7)之HIV2启动子之后,构建表达质粒载体pHi2-IL-15-CMV-TAT(L1);运用定点突变技术以IL-2的信号肽基因序列(72bp,源自质粒pHi-IL-2-CMV-TAT)置换IL-15的信号肽基因序列(144bp),构建质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT(L3);将EGFP编码基因克隆于HIV2启动子之后,构建绿荧光蛋白表达质粒pHi2-EGFP-CMV-TAT(L6)以检测转染效率。②构建CEA启动子正调控基因表达质粒载体:利用基因克隆技术,将CEA启动子基因克隆入空质粒pHi2-MCS-CMV-TAT(M7),取代其中的CMV启动子,构建空质粒pHi2-MCS-CEA-TAT(L7);再分别将IL-15(LSP-IL-15),IL-2SP-IL-15,EGFP的编码基因克隆于HIV2启动子之后,构建质粒 pHi2-IL-15-CEA-TAT(L2),pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT(L4),pHi2-EGFP-CEA-TAT(L5)。结果:质粒L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7经限制性双酶切、PCR检测和测序分析,结果表明所有质粒均已成功构建。结论:在基因克隆技术中,DNA片段克隆入质粒载体,最为关键的是酶切位点的选择,若两者有适宜的双酶切位点,则双酶切、定向克隆技术是建立基因表达载体的最佳选择;若无合适的双酶切位点,定点突变技术则是一种简便、快速、有效的方法。第二部分CEA启动子正调控IL-15基因表达质粒载体体外实验研究目的:探讨细胞因子基因治疗在恶性肿瘤治疗中的可行性,实现CEA启动子正调控IL-15基因表达质粒载体在CEA阳性肿瘤细胞内高效、特异性表达。方法:①分组:CMV启动子组质粒(L1,L3,L6,M7);CEA启动子组质粒(L2,L4,L5,L7);未转染组。②运用阳离子脂质体介导法,上述质粒体外分别转染CEA阳性结肠癌细胞系SW480细胞和CEA阴性乳腺癌细胞系MCF-7细胞,倒置荧光显微镜评估细胞转染情况,流式细胞术分析转染效率,酶联免疫吸附方法检测IL-15的表达水平。③使用SPSS 13.0 for Windows进行数据分析。结果:①质粒L6和L5均可转染CEA阳性结肠癌SW480细胞和CEA阴性乳腺癌MCF-7细胞,转染效率为21.82%;②ELISA检测结果:未转染组及质粒M7和L7(空质粒)转染SW480和MCF-7细胞后,均未见IL-15的表达;质粒L1,L2,L3,L4转染SW480细胞后,24hr和48hr上清液中IL-15的表达水平,在L1和L3之间、L2和L4之间有显著性差异(P<0.01),且L3的IL-15表达水平是 L1 的 4.3/5.9(24hr/48hr)倍,L4 的 IL-15 表达水平是 L2 的 4.8/5.3 倍;L1与L2、L3与L4之间的IL-15表达量未见显著性差异(P>0.05)。转染MCF-7细胞后,24hr和48hr上清液中IL-15的表达,L1和L3之间有显著性差异(P<0.01),L3的IL-15表达水平是L1的5.4/4.8倍;L2和L4之间无显著性差异(P>0.05);48hr的L1与L2、L1与L4之间的IL-15表达水平可见显著性差异(P<0.05)。质粒L4转染SW480和MCF-7肿瘤细胞,24hr和48hr上清液中IL-15的表达水平在两种细胞之间具有显著性差异(P<0.01),转染SW480细胞后IL-15的表达水平是转染MCF-7细胞的7.0/9.8(24hr/48hr)倍。结论:所构建之质粒均能转染肿瘤细胞,并表达目的基因产物IL-15或EGFP,而且IL-2信号肽置换IL-15信号肽后,IL-15的表达水平明显增高;CEA启动子正调控IL-15质粒表达载体转染CEA阳性细胞后IL-15表达水平等同于CMV启动子正调控IL-15质粒表达载体,CEA启动子正调控IL-15质粒表达载体在CEA阴性细胞IL-15低表达,从而实现了转导基因高效性、靶向性表达的目的,为下一步体内实验奠定了基础。