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研究背景针灸是祖国医学的重要组成部分,在治疗各种病痛方面疗效显著。临床上利用针灸的镇痛作用,可有效地进行急性痛、慢性痛、癌痛等的治疗,并开展了多种多样的外科手术和术后疼痛的治疗。甲状腺手术是针刺麻醉最佳适应证之一。术后痛是急性疼痛的一种表现形式,临床上,针刺能够缓解多种术后切口痛,减轻病人痛苦,促进康复,减少术后恶心呕吐,改善手术预后。动物实验也证明,电针可减轻大鼠足底切口痛行为反应。但是,针刺缓解颈部术后切口痛的作用机制还不清楚,研究报道鲜见。脊髓是痛觉信息进入中枢后的第一级整合中枢,脊髓背角,尤其是背角浅层,含有种类繁多的神经活性物质和受体,在脊髓水平的痛信息传递、整合及痛觉调制中扮演着中要的角色。我们前期的研究工作证明：甲状腺区手术切口后4-6小时的疼痛反应,电针扶突、合谷-内关穴区对具有较佳的镇痛效应；该镇痛效果与其下调颈段脊髓背的致痛物质P物质(SP)及其受体NK1基因及蛋白的表达,降钙基因相关肽(CGRP)蛋白的表达,调节镇痛物质5羟色胺受体亚型(5-HT1AR、5-HT2AR)基因、蛋白的活动实现的。因此,本研究拟进一步观察颈部切口痛大鼠疼痛行为变化的规律,观察电针“扶突”穴区等对该切口痛产生镇痛效应的情况下,颈段脊髓内兴奋性氨基酸受体N—甲基—D—天冬氨酸受体业型2B(N-methyl D-aspartate receptor subtype2B, NMDAR2B)、代谢型谷氨酸受体亚型5(metabotropic glutamate receptor subtype5,mGluR5)、抑制性氨基酸γ-氨基丁酸B1受体(γ-aminobutyric acid B1receptor,GABAB1R)、细胞内腺苷-3’,5’-环化-磷酸(cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)/促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/环腺苷酸应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)信号通路活动(表达)的变化,探讨电针缓解颈部切口痛的脊髓机制,为临床针麻行甲状腺手术、针刺治疗术后痛提供实验依据。材料与方法雄性Wistar大鼠122只,随机分为正常对照(n-22),模型组(n=34),扶突穴组(n=22),合谷-内关组(n=22),足三里-阳陵泉组(n=22)。异氟烷麻醉下,于大鼠颈部做一长约1.5cm纵形切口,复制切口疼痛模型。各治疗组在造模4h、24h、48h后给予电针上述诸穴区各30min(2/15Hz,15min,1mA；15min,2mA),用热辐射法分别在术前、术后4h、24h、48h电针前后照射大鼠颈部／切口引起的躲避潜伏期作为衡量动物痛反应的阈值(每组8例)。在麻醉状态下,取C1-C4段脊髓背侧部分的组织液氮研磨提取RNA和蛋白,用荧光定量RT-PCR法和Western blot方法检测大鼠颈部C1～C4段脊髓背侧等区域组织细胞膜兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸受体基因及蛋白(mGluR5mRNA、mGluR5蛋白、NMDAR2B蛋白和GABAB1R蛋白)水平的表达变化及细胞内激酶/核转录因子mRNA水平和蛋白水平(cAMP mRNA/MAPK mRNA/CREB mRNA和CREB蛋白、p-CREB蛋白)的变化趋势检测观察,更深入地分析电针镇痛行甲状腺手术的分子生物学机制。其中RT-PCR实验方法检测相应物质机因水平的变化(每组样品8例),Western blot实验方法检测相应物质蛋白水平的变化(每组样品6例)。结果1电针扶突穴等缓解颈部切口创伤大鼠痛行为反应的效应与颈部切口术前痛阈(模型组17.80±1.52sec,扶突穴组17.88±1.89sec,合谷-内关组18.77±3.22sec,足三里阳陵泉组17.63±2.18sec)比较,甲状腺区切口术后模型组动物的躲避潜伏期(模型组11.29±0.99sec,扶突穴组11.45±2.02sec,合谷-内关组12.01±1.38sec,足三里阳陵泉组11.2±1.72sec)明显缩短(P<0.05),痛阈降低。与同时期模型组比(术后4h：11.12±1.OOsec,术后1d：11.64±0.97sec,术后2d：11.68±1.40sec),电针扶突穴(16.7±1.97sec,17.76±1.94sec,16.98±1.84sec)、合谷-内关组(17.3±2.1sec,18.15±1.28sec,17.91±2.31sec)动物的痛阈明显升高,具有统计学差异(P<0.05)；而电针足三里-阳陵泉组的痛阈值(12.15±2.53sec,11.98±1.72sec,12.18±1.79sec)未见明显变化(P>0.05)。2电针对术后48h颈部切口痛大鼠颈髓GABA/Glu受体表达的影响荧光定量Real Time-PCR结果显示,颈部切口术后,与正常对照组比较(0.56±0.04),模型组动物脊髓背侧mGluR5mRNA表达量(1.01±0.01)显著增高(P<0.05)。与模型组比较,电针扶突穴组mGluR5mRNA的表达量(0.83±0.17)轻度降低(P>0.05),但是比电针合谷-内关组(1.04±0.13)、足三里-阳陵泉组(1.03±0.05)作用明显(P<0.05)；电针足三里-阳陵泉穴,合谷-内关组颈髓背侧mGluR mRNA的表达量变化不大(P>0.05)。Western blot结果显示：颈部切口术后,模型组mGluR5蛋白表达量(1.43±0.04)比正常组(0.98±0.04)明显增多(P<0.05)。电针各组mGluR蛋白的表达量(1.22±0.04,1.06±0.04,1.14±0.04)均明显降低(P<0.05)。模型组NMDAR2B蛋白表达量(0.46±0.04)比正常对照组(0.44±0.04)增多,但未达显著差异(P>0.05);电针各组基本没明显变化(0.41±0.03,0.45±0.04,0.43±0.()5),差异均无统计学意义(均P>0.05)。颈部切口术后,与正常对照组(0.64±0.15)比较,模型组GABAB1R蛋白表达量(0.56±0.01)降低,针刺扶突穴组GABAB1R蛋白表达量(0.61±0.03)增多,针刺合谷-内关组,足三里-阳陵泉组(0.54±0.04,0.56±0.05)基本没变化,差异均无统计学意义(均P>0.05)。3电针对术后48h颈部切口痛大鼠颈髓背角细胞内cAMP/MAPK/CREB信号通路活动的影响术后,与正常组比(0.21±0.06,0.54±0.11),模型组颈髓背侧cAMP mRNA、 CREBmRNA表达量(0.53±0.11,3.32±0.68)均明显升高(P<0.05)。与模型组比,电针“扶突”后cAMP mRNA、CREB mRNA表达量(0.13±0.02,0.39±0.01)显著降低(P<0.05),而电针“合谷-内关穴”(0.47±0.06,2.97±0.57)以及“足三里-阳陵泉”(0.51±0.09,3.71±0.64)的效果不明显(P>0.05)。电针“扶突穴”下调cAMP、CREB基因表达的作用,明显优于电针“合谷-内关穴”以及“足三里-阳陵泉”穴区(P<0.05)。与正常组(1.38±0.1)比较,模型组颈髓背角MAPK mRNA表达量(1.72±0.36)增多,但未达显著差异(P>0.05);针刺各组(1.68±0.17,1.77±0.4,1.91±0.33)基本没明显变化,差异均无统计学意义(均P>0.05)。术后,模型组CREB蛋白表达量(0.65±0.16)比正常组(0.64±0.03)增多,针刺扶突穴组CREB蛋白表达量(0.54±0.13)降低,但未达显著差异(P>0.05);针刺合谷-内关组,足三里-阳陵泉组CREB蛋白表达量(0.43±0.04,0.33±0.03)明显降低(P<0.05)。与正常对照组(0.31±0.02)比较,模型组p-CREB蛋白表达量(0.42±0.03)显著增高(P<0.05)。与模型组比较,电针扶突穴组,合谷-内关组p-CREB蛋白表达量(0.31±0.05,0.29±0.02)均明显降低(P<0.05),针刺足三里-阳陵泉组p-CREB蛋白的表达量(0.34±0.05)无明显变化(P>0.05)。结论1大鼠颈部切口创伤可引起的明显的痛反应,使大鼠痛阈降低,并可持续约5天；电针扶突、合谷-内关穴可明显抑制切口痛大鼠的疼痛反应；2电针扶突穴区产生镇痛效应时可明显抑制切口痛引起的脊髓颈段背侧区兴奋性氨基酸受体mGluR5mRNA及mGluR5蛋白的表达显著升高,轻度升高GABABIR蛋白的表达,表明电针“扶突”穴有下调术后脊髓C1-C4段背侧兴奋性氨基酸mGluR5mRNA及mGluRB蛋白的表达,上调GABABIR蛋白的表达的作用。3电针扶突穴区产生镇痛效应时可明显下调cAMP mRNA, CREB mRNA, p-CREB蛋白的表达,提示电针“扶突”穴可以抑制脊髓C1～C4段背角细胞内cAMP/MAPK/CREB信号通路的活动。