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目的：增强子(enhancer)是上调基因表达的顺式(cis)元件，其上调基因表达的机理尚有许多值得研究之处。本研究室前期工作证明，SV40PolyA序列中一段长22bp的片段(称为22R，5’-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT)能活化GFP报告基因，22R的变异体有的可以活化GFP报告基因有的不能活化GFP报告基因，如4TMI(5’-GTGAAATAAATGCTTTTTTTGT)可以活化GFP报告基因，22R4C(5’-GTGAAAAAAATGCTTTCTTTGT)不活化GFP报告基因。 为什么类似的序列活化基因作用不同，为弄清碱基片段和单个碱基在活化基因中的作用，我们对22R序列进行突变，发现AA(5’-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT)可以活化GFP报告基因，而7pieA(5’-GTGAAAAAAATGCAAAAAAAGT)不能活化GFP报告基因，显然AA中的第7位T和第17位T对于活化GFP报告基因有作用，那么AA中的其他T碱基是否也参与活化基因过程呢?于是又对AA序列中的第2、第11和第22位“T”进行突变，研究这几个位点T碱基突变对GFP报告基因表达的影响。 方法： 1、引物和作为模板的DNA片段设计带有适当酶切位点的引物和DNA片段模板，委托DNA合成公司合成。表1列出本文中合成的引物和作为模板的DNA片段。 2、重组质粒构建以人工合成的带有突变位点的序列为模板，用带有适当酶切位点的引物扩增目的片段，酶切后插入pEGFP-C1质粒，获得插入1个目的片段的重组质粒(×1重组质粒)，用HindⅢ/XbaⅠ酶切×1重组质粒，胶回收大片段，用HindⅢ/NheⅠ酶切×1重组质粒，胶回收小片段，用T4DNA连接酶连接大、小片段，得到同向二串连体插入质粒(×2重组质粒)。将×2重组质粒用HindⅢ/NheⅠ酶切，胶回收小片段，连入经HindⅢ/XbaⅠ酶切的Cl-Alu14质粒(pEGFP-C1质粒的GFP基因下游同向、正向插入14个Alu)的GFP和串联Alu序列之间。 3、细胞转染和荧光观察将重组质粒用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞，荧光显微镜下计数GFP荧光阳性细胞比例并照相。 4、流式细胞分析委托河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞分析室完成。 结果： 1、重组表达载体构建和鉴定重组表达载体经酶切和测序鉴定正确。 2、AA序列解除Alu串连序列对GFP基因的抑制作用C1-AA×2-Alu14，C1-Alu14，pEGFP-C1质粒分别转染到HeLa细胞做荧光显微镜观察并计数。荧光细胞阳性率六次试验均值分别为：C1-AA×2-Alu147.39±0.91％，C1-Alu140.69±0.11％，pEGFP-C180.50±1.33％。 C1-AA×2-Alu14和C1-Alu14质粒转染细胞的流式细胞仪测定结果显示，用HeLa细胞作为对照(荧光强度>100)，C1-Alu14质粒荧光阳性的细胞数为21.47％，C1-AA×2-Alu14质粒荧光阳性的细胞数为44.96％。如果计算强荧光细胞的比例(荧光强度>102的细胞数/总的细胞数)，荧光阳性细胞百分数分别为5.0％和0.1％。这些结果与荧光阳性计数结果呈一致性。C1-AA×2-Alu14能解除Alu14对GFP基因的抑制作用。 3、AA序列点突变对GFP基因表达的影响 AA序列点突变后重组质粒分别转染到HeLa细胞做荧光显微镜观察并计数，荧光细胞阳性率六次试验均值分别为：C1-AAMFA×2-Alu143.59±0.27％，C1-AAMFC×2-Alu145.78±1.09％，C1-AAMFG×2-Alu142.95±0.70％，C1-AAMSeA×2-Alu144.02±1.06％，C1-AAMSeC×2-Alu144.28±1.29％，C1-AAMSeG×2-Alu143.70±0.86％，C1-AAMThA×2-Alu147.09±1.60％，C1-AAMThC×2-Alu145.25±1.33％，C1-AAMThG×2-Alu143.02±0.74％，C1-AA×2-Alu147.39±0.91％，C1-Alu140.69±0.11％。 流式细胞仪测定结果显示，如果计算强荧光细胞的比例(荧光强度>102的细胞数/总的细胞数)，荧光阳性细胞百分数分别为：C1-AAMFA×2.Alu141.87％，C1-AAMFC×2-Alu144.22％，C1-AAMFG×2-Alu140.96％，C1-AAMSeA×2-Alu142.35％，C1-AAMSeC×2-Alu142.67％，C1-AAMSeG×2-Alu142.58％，C1-A AMThA×2-Alu144.78％，C1-AAMThC×2-Alu143.26％，C1-AAMThG×2-Alu142.21%，C1-AA×2-Alu145.00％，C1-Alu140.10％。 这些结果与荧光计数结果呈一致性，AA序列点突变后重组质粒的荧光细胞阳性率均高于Alu串连序列重组质粒，但均低于插入AA序列的质粒的荧光细胞阳性率。 4、本研究室发现多个增强子，如22R(5’-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT)，4TMI(5’-GTGAAATAAATGCTTTTTTTGT)，AA(5’-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT)，5AMI(5’-GTGAATAAAATGCTTTAATTGT)等，这些增强子的共同特点是：以A、T碱基为主，以TGC为中心两翼有对称趋势。为了研究RNA小片段中A、U字符串比例是否也占优势，我们对HeLa等5种细胞中表达基因所产生的RNA小片段组成进行了分析。发现5种细胞RNA小片段组成中“UUUU”和“AAAA”字符串含量最高，且“UUUU”字符串比例高于“AAAA”字符串。 结论： 1、增强子AA序列(5’-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT)能解除Alu串连序列对GFP基因的抑制作用，具有活化基因作用。 2、对AA中另外3个T碱基位点(2、11、22位)的突变说明，这3个T碱基也对AA的增强子活性产生影响。所有的9个单碱基突变序列，活化基因作用均低于AA序列，但是均高于Alu14质粒。 3、用字符串的方法生物信息学分析HeLa等5种细胞的RNA小片段组成，发现“UUUU”字符串比例最多，其次为“AAAA”字符串。RNA小片段以U字符串和A字符串为主，这一现象是否与本文中发现的增强子A、T碱基占优势有关值得进一步研究。