牙周炎是一种发病普遍的口腔疾病,在牙周炎中,牙周支持组织既表现出慢性炎症性改变的基本规律如血管增加充血等,又会引发牙槽骨的吸收从而导致组织的进展性破坏及修复困难;当大量牙周支持组织丧失后将导致牙齿缺失,危害人类口腔健康,目前对于牙周病组织的再生性修复还存在一定困难。对牙周炎病理变化的研究可以让人们更好的了解该疾病的发生发展,为治疗牙周炎提供新思路,因此具有重要意义。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有重要细胞生物学作用,包括多向分化以及旁分泌调节邻近细胞功能等等。在生理状态下,牙周组织的成骨机制与成血管机制有着密切的联系,而在细胞层面上,MSCs与内皮细胞(Endothelial cells,ECs)也有着密切的联系。有研究表明在有ECs存在的情况下,MSCs自身的功能性状也会发生改变。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)作为一种存在于牙周支持组织内的MSCs,具有和一般MSCs类似的性质。PDLSCs也可能通过旁分泌对其周围的细胞和环境产生影响。但是有研究表明在炎症环境下,PDLSCs自身的生物学功能发生了改变,炎性环境会导致其成骨分化的能力大大降低。那么牙周炎症时,PDLSCs与其周围细胞如ECs及微环境间的交互作用也可能发生了改变,从而影响了牙周炎的病理表现。炎性PDLSCs与ECs的交互作用可能会改变炎性PDLSCs的成骨功能及促血管生成功能,而在这一方面尚没有明确的研究报道。牙周炎症时,牙周组织内的成骨效应降低,而血管系统也发生了改变。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)与血管的发生密切相关,在牙周组织如牙龈及龈沟液等都可以检测到高表达的VEGF,炎性牙周组织中增生的血管以及增高的VEGF可以使更多的炎性细胞及因子渗透入炎症局部,从而增加或维持牙周炎的病理状况。又有研究显示在炎性环境的作用下,牙龈成纤维细胞的EKR磷酸化水平会增高且VEGF的表达也增高,因此我们推测,炎性环境或许也通过ERK使PDLSCs旁分泌VEGF的性能发生改变,从而改变了牙周组织中的血管形成,引起了微环境变化。另外,不少研究表明ERK通路与自噬之间存在着调控关系,而自噬对于MSCs的细胞生物学功能等多个方面均具有重要影响。若PDLSCs可以通过ERK通路调控ECs血管化能力,那么自噬是否也参与到了其中?目前,对于炎性PDLSCs如何通过旁分泌途径与其微环境相互影响的作用机制还少有研究。本课题着眼于此,尝试探讨旁分泌机制下炎性微环境中PDLSCs的成骨及促ECs成血管能力的变化,主要分为以下三个部分进行:第一部分炎性环境下ECs对PDLSCs成骨分化能力的影响【实验目的】探讨炎症状态PDLSCs在ECs旁分泌的影响下成骨分化能力水平的变化。【实验方法】获取和培养正常及炎症来源的PDLSCs,并用炎性因子TNF-α为PDLSCs制造炎性环境,然后用ECs条件培养液(ECs-conditioned medium,ECCM)培养以及与ECs间接共培养的方法处理正常及炎症状态下的PDLSCs,采用Western blot及qRT-PCR观察干预后PDLSCs的成骨分化能力指标ALP、OCN等的变化。为了排除细胞凋亡水平对于其成骨分化能力的影响,实验将正常与炎症的PDLSCs与ECs共培养后,用凋亡染色试剂于流式细胞仪上检测PDLSCs的凋亡水平是否有变化。【实验结果】在ECCM的影响下,正常及炎症PDLSCs的成骨分化能力相关指标ALP和OCN等没有明显变化;在与ECs间接共培养的条件下,正常及炎症PDLSCs的各项成骨分化能力相关指标均有所下降;在与ECs间接共培养的条件下,炎症PDLSCs的凋亡水平有所下降。【结论】在ECs的旁分泌机制下,正常与炎症环境下的PDLSCs成骨分化均有所下降,这种现象很可能与ECs和PDLSCs的交互作用有关。且ECs引起的PDLSCs成骨分化水平下降并非由于PDLSCs的细胞状态下降引起,相反,ECs降低了炎性状态下PDLSCs的凋亡水平。第二部分炎性环境对PDLSCs促ECs血管形成能力的影响【实验目的】探讨炎性PDLSCs促ECs血管形成能力的变化及VEGF在其中的作用;探讨ERK在PDLSCs促ECs血管形成中的作用。【实验方法】通过免疫组化、Western blot及qRT-PCR的方法比较炎症与正常牙周膜组织中VEGF的表达量,而后通过qRT-PCR和ELISA检测炎性因子(TNF-α和IL-1β)处理PDLSCs后的VEGF表达量变化以验证PDLSCs在炎性环境下是否分泌VEGF增加。为了直接检测炎性PDLSCs影响ECs血管形成的作用,将炎性PDLSCs与正常或炎症状态ECs间接共培养后用Matrigel基质胶管腔形成试验和qRT-PCR检测ECs血管形成能力的变化。利用VEGF中和抗体试验中和掉PDLSCs分泌的VEGF后,基质胶管腔形成试验和qRT-PCR检测ECs血管形成的变化以确定VEGF在PDLSCs调控ECs血管化中的作用。研究ERK在PDLSCs促ECs血管形成中的作用时,首先进行Western blot检测以观察炎性环境对于PDLSCs中ERK通路的影响,随后用U0126阻断正常或炎症状态PDLSCs的ERK通路后,qRT-PCR和ELISA检测其VEGF的分泌表达变化,以及基质胶管腔形成试验和qRT-PCR检测与其共培养的ECs血管形成能力变化。【实验结果】炎症牙周膜组织中的VEGF表达较正常组织高;炎性环境下PDLSCs分泌VEGF增加;炎性PDLSCs较炎性环境自身更能促进ECs形成血管,且其调控通过VEGF旁分泌机制进行;炎性PDLSCs促ECs血管形成能力随着炎性因子作用时间的延长先升高后有所下降;炎性环境提高了PDLSCs中ERK的磷酸化水平,从而促进VEGF的分泌;ERK通路参与调控了炎性PDLSCs促ECs血管形成的过程。【结论】虽然炎性环境自身对ECs的成血管能力有影响,但炎性PDLSCs对于促ECs血管形成具有更显著的作用。炎性环境可以激活提高PDLSCs中的ERK通路,而ERK通路调控了炎性环境下PDLSCs中VEGF的表达和分泌。ERK激活水平增高时,VEGF的分泌表达同时也增高,使ECs的血管化程度增加。因此,ERK通路调控了炎性PDLSCs促ECs血管化的能力。第三部分自噬对于PDLSCs促ECs血管形成能力的影响【实验目的】1、探索炎性环境下PDLSCs自噬水平的变化;2、探索在炎症环境下PDLSCs中ERK与自噬的关系;3、探索自噬在炎性PDLSCs促ECs血管形成中的作用。【实验方法】有文献报道ERK可以调控自噬进而调控MSCs各项功能,于是我们首先检测了炎性环境下PDLSCs的自噬水平变化。从上一部分可以得出炎性PDLSCs促ECs血管形成能力随着炎性因子作用时间的延长先升高后下降,因此我们用Western blot和qRT-PCR的方法检测相同时间点(2天和7天)炎性因子刺激下PDLSCs中LC3及其他自噬相关蛋白的变化。其次,用炎性因子和U0126分别提高和阻断PDLSCs中的ERK通路,然后用相同方法检测PDLSCs中LC3及其他自噬相关蛋白的表达情况以观察ERK通路对于PDLSCs自噬水平的影响。为了探索自噬在炎性PDLSCs促ECs血管形成中的作用,我们对炎性因子刺激7天的PDLSCs施加雷帕霉素(Rapamycin)以提升其自噬水平,然后将其与ECs共培养,Matrigel基质胶管腔形成试验和qRT-PCR检测ECs血管形成能力的变化。最后用Si-Beclin-1转染的办法降低炎性因子刺激2天后的PDLSCs的自噬水平,再利用相同方法检测其促ECs血管形成的能力。【实验结果】炎性环境下的PDLSCs自噬水平先升高后有所下降,与其促ECs血管形成能力趋势相一致;ERK可以正向调控PDLSCs的自噬水平,表现为炎性因子作用下ERK水平增高,自噬相关蛋白LC3 II和Beclin-1等均随之升高,而在阻断ERK通路后,炎性PDLSCs中相应的自噬相关蛋白表达均下降;提高炎症因子刺激7天的PDLSCs自噬水平后,其促ECs血管形成能力增加;降低炎性因子刺激2天的PDLSCs自噬水平,其促ECs血管形成能力也相应减弱。【结论】在炎性条件下,PDLSCs细胞的自噬水平先增高后有所降低。ERK参与调控了PDLSCs的自噬水平,表现为ERK通路激活水平高时,PDLSCs的自噬水平也提高,而在阻断ERK通路时,自噬水平相应降低。自噬也参与调控了炎性PDLSCs促ECs血管形成的过程,自噬升高时,炎性PDLSCs促ECs血管形成能力高,而在自噬降低时,ECs血管形成也相应下降。