鸡舍环境中镰孢菌的种类及真菌毒素检测

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本研究利用tri5特征性引物对分离自包括空气、饲料、土壤、积尘和饮用水在内的鸡舍环境基质中的镰孢菌分离株基因组DNA扩增来快速筛选产毒镰孢菌,并通过正交试验设计方法对tri5阳性菌株进行产毒培养,采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱(HPLC)方法对产毒培养产物和鸡舍空气及基质样品进行T-2毒素和HT-2毒素进行定性和定量分析,明确T-2毒素和产毒镰孢菌的数量关系,在建立空气和周围基质之间镰孢菌—产毒镰孢菌—T-2和HT-2毒素量化关系的基础上,初步探明鸡舍气载镰孢菌及T-2毒素的发生规律,为人类和动物气传真菌病的预防和控制提供理论依据。分别在2009年11月和2010年4月采集鸡舍空气样品19份,基质(包括土壤、积尘、饲料、饮用水)样品共164份。对10份空气样品和40份基质样品中的镰孢菌进行分离鉴定,得到来自空气中的59株和来自其他基质中的80株共139株镰孢菌分离株,其中拟轮枝镰孢和半裸镰孢为优势菌种,所占比例分别为23.74%和17.26%。不同类型基质中,土壤中的镰孢菌浓度最高;不同类型鸡舍中,种鸡舍中获得的镰孢菌分离株最多。tri5-PCR对139株镰孢菌分离株的基因组DNA进行特异性扩增,得到42株tri5~+镰孢菌,其中tri5~+菌株数量最多的镰孢菌种类为禾谷镰孢菌,土壤中分离筛选的tri5~+镰孢菌的比例最高。对空气中得到的10株tri5~+镰孢菌按照40号F. semitectum的最佳产毒培养条件进行产毒培养,HPLC检测培养产物,7株镰孢菌产生T-2毒素,浓度范围为1.3ng/mL~5ng/mL,3株产生了HT-2毒素,浓度最高为17.1ng/mL。按照国家检验检疫局质量检测标准,采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱方法检测鸡舍环境基质中的T-2毒素(包括HT-2毒素)、黄曲霉毒素(AF)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和赭曲霉毒素A(OTA)。检测结果表明,所有环境基质中均检测到T-2毒素,以土壤中的毒素浓度最高,为21μg/kg,除饲料以外的基质中未检测到OTA和ZEA的存在,饲料中的OTA和ZEA水平在冬季和春季有明显差异,冬季与春季饲料样品中的ZEA浓度具有显著差异(P<0.05),所有样品中均未检测到AF的检测结果在检测方法定量限以下。
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