研究背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)作为我国最常见的恶性肿瘤之一,也是世界上第五大最常见的恶性肿瘤,据估计全球每年新增加的HCC病例已经将近100万[1]。已有研究证明,在目前发现的众多诱发HCC的危险因素中,慢性肝病为其最主要因素[2],在全球的不同地域,诱发HCC的主要危险因素也有所差异,这或许与经济水平,饮食习惯及生活习惯密切相关。以东亚和撒哈拉以南的非洲为例,在这些地区诱发HCC的主要危险因素为慢性乙型肝炎及黄曲霉毒素[3],而在北美、欧洲及日本的HCC患者中,大多数是由丙型肝炎病毒及酒精性肝损害所致[4]。相对于如此高的发病率,HCC的预后却不尽如人意,与其他恶性肿瘤相比较,其病死率非常高,约占我国恶性肿瘤病死率的第二位,分析其主要原因是由于HCC的增殖及转移能力均较强,大部分被确诊HCC的患者都属于中晚期,因此治疗效果相对较差,预后很不理想,目前研究发现HCC患者总体的5年生存率仍不足5%[5]。要想提高此类患者的长期生存率,就必须要做到早期发现、早期诊断、早期治疗。而要做到这几点必须清楚HCC的流行病学特点。相对于其他地区我国是肝炎大国,尤其是乙型肝炎的发生率较高,随着肝炎的病程进展,大多数患者最终都会发展成为HCC,据研究,乙型肝炎患者与非乙型肝炎病毒携带者相比,其HCC的发生率在百倍以上[6]。因此,为了避免HCC的发生,必须通过有效的抗病毒治疗,阻止乙型肝炎病毒感染的患者发生肝硬化,因为一旦发生肝硬化,即使对患者进行了有效的抗病毒治疗,也将很难阻止HCC的发生[7]。临床上,用于HCC诊断的方法也多种多样,而影像学检查是目前用于诊断HCC的主要手段,包括超声、四相多层螺旋CT扫描或动态对比增强MRI,如果患者的影像学特点不明确时可选择肝穿刺活检。此外对于怀疑早期HCC患者,为明确其肿瘤原发细胞的特点或评估是否有新生血管的形成,国际指南也推荐采用免疫学的方法来进行分析[8]。然而分子工具由于受到组织样本获取量的限制,目前还不能真正用于个体化诊断上[9]。无论用何种方法,一旦确诊为HCC,就需要对其进行分期,这不仅是因为所有治疗方案的选择均需根据分期来决定,也因为临床上可以通过对肿瘤进行分期来帮助判断它的预后。肝癌分期系统在临床上应用最多的有以下几种:美国癌症联合委员会分期(TNM)、巴塞罗那肝癌小组分期方法(BCLC)、意大利肝癌小组分期方法(CLIP),中国肝癌协会分期(CUPI)和日本的JIS分期等[10]。根据肿瘤分期的不同,采取相应的治疗方案,临床上针对HCC患者的治疗,也有许多方法可以采用,对于早期且不合并转移的患者,临床上常用的治疗方法主要有:外科切除或肝脏移植,然而患者术前肝功能情况及供体器官的缺乏却常常限制其应用[8,11]。此外,也有研究证实,射频消融术(RFA)、肝动脉栓塞化疗(TACE)等局部治疗方法可以延长HCC患者的中位生存时间,但这些方法并不适用于那些存在血行转移或肝外扩散的患者。总之,对于那些转移性HCC患者来说,其治疗手段非常有限。近年来,分子生物学领域的研究为HCC在病因学治疗上开拓了新的方向,为对其进行靶向治疗创造了机会,但是在分子学水平上HCC的发病机制非常复杂,大量信号分子参与HCC复杂的发生过程,从而影响肿瘤的发生及抑制。可以说,HCC的形成是包括肝细胞损伤、炎症反应、基因不稳定等在内的复杂过程,在这个过程中,可能涉及多血管肿瘤、血管再生等诸多环节。而作为促血管生成因子的VEGF、PDGFs、FGF、TGF-α、TGF-β等均通过对血管生成信号的激活,引起RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR等重要路径的活化[12]。从而促进HCC的发生。综上所述,寻求新的治疗靶标,以期改善HCC患者的预后,成为目前研究的热点。近年来,许多国内外学者对多种可能导致HCC生长转移的信号途径进行研究,以期提高HCC患者的生存率,寻找新的药物治疗靶点。这其中,也不乏对于蛋白酶激活受体家族的研究,蛋白酶激活受体(PARs)是一种7次跨膜的G蛋白偶联受体,其主要包括PAR1、PAR2、PAR3和PAR4四种亚型,作为各种蛋白水解酶信号传递的靶点。PARs的特点是具有一种独特的激活机制,涉及到激活受体的拴系配体的蛋白降解。这些受体在体内不仅参与血管调节、痛觉感受、炎症反应[13-16]等多种生理过程的调节,而且也参与包括组织纤维化[17]、肿瘤[18-25]的发生等许多疾病的病理过程。鉴于这些受体在癌症以及心血管、肌肉骨骼、胃肠道、呼吸系统和中枢神经系统疾病中的新作用,PARs已成为新疗法发展的靶点。从20世纪60年代中期开始,人们就知道胃蛋白酶和糜蛋白酶会引起靶组织中的激素样效应,例如促进大鼠膈肌中糖原的形成。此外,凝血酶和胰蛋白酶在细胞膜上的有丝分裂作用早在20世纪70年代早期开始就已被人们所认识。然而,负责这些蛋白酶作用的受体,所谓的蛋白酶激活受体(PAR)家族的G蛋白偶联受体(GPCRs)直到最近才被发现。考虑到PARs在正常和病理组织功能中的广泛作用,这些受体正成为关节炎、结肠炎、哮喘、神经退行性疾病、肿瘤侵袭和心血管疾病等多种疾病的潜在治疗靶点。不同的PARs家族成员,在不同的病理过程中发挥的作用并不相同,而其中的PAR2亚型在肿瘤细胞表达、肿瘤的生长转移等方面的作用,备受关注。除此之外,肿瘤的发生发展还可能与多种的分子途径有关,比如组织因子(TF),作为一种跨膜糖蛋白,可以与FⅦ/VⅦa因子形成复合物,成为癌症患者凝血系统的主要激活物。在炎症微环境中,TF/FVⅡa在肿瘤细胞和免疫细胞释放的胞外囊泡表面形成复合物,该复合物可以明显加重癌症患者的凝血功能紊乱的情况,从而对癌症患者产生有害的影响。每个PAR亚型都会被一种特殊的、重叠的络氨酸蛋白酶激活。PAR2的主要激活物是胰蛋白酶,除胰蛋白酶外,PAR2还可以被TF/FVⅡ/Ⅶa)/Xa等激活。并且可以通过PAR2诱导肿瘤细胞迁移。在体外,也可以用来自于体外的合成短肽对其进行激活,即所谓的激活肽(PAR-APs)。能够在没有受体蛋白水解的情况下特定激活PAR。这些PAR激活肽已经成为研究PAR功能的有用工具。已有研究证实[26],在肝脏和胰腺的肿瘤组织中,PAR2参与了肿瘤细胞的纤维化形成。另外,在胰腺癌组织中还可以看到其促结缔组织的增生反应,这些包括肿瘤细胞基质在内的肿瘤微环境对于肿瘤的生长及转移能力至关重要。而所谓的细胞基质是由包括肌成纤维细胞/星状细胞,与癌相关的成纤维细胞以及各种类型的免疫细胞所组成。肿瘤细胞与基质细胞的相互作用可以促进原发肿瘤的生长和转移。虽然在皮肤肿瘤中,PAR2被认为是一种肿瘤抑制因子[27],但是PAR家族的成员大多被认为与癌症的发生和进展有关。因为其能够控制包括HCC在内的不同肿瘤的生长,侵袭和转移。在胰腺癌细胞中PAR2的水平和PAR2的活化诱导了它们的增殖、迁移和侵袭。然而,在结直肠癌中,PAR2和PAR1均可在正常基质中表达,但在肿瘤细胞基质中的表达会增加。在胃癌组织中,PAR2的表达与肿瘤侵袭胃壁的深度、淋巴管和静脉浸润以及是否发生肝转移密切相关。目前已有研究分析了从肝星状细胞(HSCs)中分泌的PAR2对肝细胞肝癌增长的作用。体内研究表明,HSC细胞系LX-2可以促进肿瘤生长并且可以刺激HCC异种移植的小鼠中的血管生成。但是当在RNAi作用下通过多种信号途径导致PAR2基因表达下调时,肿瘤细胞的生长及转移的效果会显著降低。由此证实,PAR2基因的表达在促进HCC的生长中起着至关重要的作用,可以将它作为HCC治疗的新靶标。研究目的1.评估肝癌患者组织中PAR2mRNA和蛋白的表达水平,证实在肝细胞癌组织中存在PAR2的高表达。2.研究PAR2的表达对不同肝癌细胞系体外增殖、侵袭及转移能力的影响。3.探讨PAR2的表达对不同肝癌细胞系体内增殖及转移能力的影响。4.探讨PAR2促进HCC细胞转移的下游机制。实验方法1.通过免疫组织化学方法评估HCC患者肿瘤组织中PAR2的表达水平,比较分析PAR2高表达组与低表达组的肿瘤进展水平,肿瘤体积及微血管的侵袭率,分析两组患者的无病生存期(DFS)及总生存期(OS)。2.使用慢病毒介导shRNA在HepG2和SMMC-7721细胞中稳定敲低PAR2表达(命名为shPAR2),构建pcDNA3.1-PAR2载体,并将其转染到HepG2和SMMC-7721细胞中,从而实现PAR2的瞬时过表达。3.使用细胞计数试剂盒8(CCK8)和克隆形成实验测试PAR2促进HCC细胞增殖的作用,transwell和划痕实验测定细胞的侵袭及迁移能力。4.裸鼠皮下注射稳定敲低PAR2的HepG2和SMMC-7721细胞建立肿瘤异种移植模型,评估细胞的体内增殖;脾内注射稳定敲低PAR2的HepG2和SMMC-7721细胞建立肝转移模型,评估在裸鼠中的转移能力。5.通过蛋白印迹分析来检测细胞中MAPK和EMT标志物的表达水平。实验结果1.PAR2高表达组与PAR2低表达组患者的肿瘤进展水平,肿瘤大小、微血管入侵率有显著差异(P值分别为0.001、0.032、0.037),肿瘤中表达高水平PAR2患者的OS和DFS显著低于PAR2表达水平较低的患者(P值分别是0.03、0.02)。2.使用慢病毒介导的shRNA在HepG2和SMMC-7721细胞中稳定敲低PAR2表达建立稳转细胞系(命名为shPAR2),与阴性对照组(命名为shNC)相比其PAR2的RNA表达水平与蛋白表达水平均显著下降(P<0.01);构建pcDNA3.1-PAR2载体,并将其转染至HepG2和SMMC-7721细胞中,与空的pcDNA3.1质粒转染组相比其PAR2的RNA表达水平与蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。3.慢病毒介导的RNAi稳定敲低PAR2后,在HepG2细胞和SMMC-7721细胞与对照组相比其细胞计数及克隆形成数量均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01、P<0.001),其在含有和不含有基质胶涂层的Transwell实验中,下室细胞数量下降,差异具有统计学意义(P<0.05、P<0.01),在划痕实验中,观察其24小时、48小时迁移速度比对照组明显下降;转染pcDNA3.1-PAR2,瞬时高表达PAR2后,两种细胞系的细胞数量及克隆形成数量均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),其在含有和不含有基质胶涂层的Transwell实验中,下室细胞数量增加,差异具有统计学意义(P<0.01),在划痕实验中,其24小时、48小时的细胞迁移速度比对照组明显增快。4.裸鼠皮下注射被稳定敲低PAR2的HepG2和SMMC-7721细胞,4周后皮下肿瘤体积及重量均较对照组有显著差异(P<0.01,P<0.001);将稳定敲低PAR2的HepG2和SMMC-7721细胞注入裸鼠脾脏,4周后肝脏上的肿瘤计数及发生肝转移的小鼠的百分比与对照组有显著差异(P<0.01)。5.敲除PAR2后HepG2和SMMC-7721细胞内处于激活状态的磷酸化ERK表达下降,细胞形态表现出明显的趋于上皮表型的变化;PAR2被敲低时,E-钙粘蛋白上调,N-钙粘蛋白下调;瞬时过表达PAR2后,E-钙粘蛋白下调,N-钙粘蛋白上调。实验结论1.PAR2可以促进肝细胞癌的增殖、侵袭和转移。2.PAR2通过激活ERK,诱导上皮-间质转化,从而促进肝细胞癌的增殖。