研究目的:宫颈癌(Cervical cancer)是发展中国家和地区女性生殖系统的第一高发恶性肿瘤,严重危害妇女健康。80%的患者在确定诊断时已经发展至局部晚期,根治性放疗是局部晚期宫颈癌的主要治疗方式。尽管联合顺铂为基础的同步化疗进一步显著提高患者生存率和局部控制率,但局部晚期宫颈癌患者根治性放化疗后,5年生存率为50-70%。明确宫颈癌细胞增殖的影响因素或调节机理,是目前临床亟待研究解决的重要问题。以往研究表明,Wnt信号是细胞增殖分化的重要调控途径,Wnt信号的异常激活可促进肿瘤细胞异常增殖。microRNA近年来发现亦参与调节肿瘤细胞增殖,其中miR-182在多种肿瘤细胞中都被证实具有促进增殖的作用。本课题组前期通过生物信息学预测分析和预实验,推测宫颈癌miR-182和APC分子存在功能上调控关,miR-182可能负向调节Wnt信号通路关键分子APC,从而导致Wn信号激活和肿瘤细胞增殖等生物学变化。因此,本课题以人类宫颈癌细胞株HeLa和SiHa细胞作为体外实验模型,发现miR-182能够提高宫颈癌细胞增殖能力,并通过靶向抑制APC表达,从而使Wnt信号异常激活,本研究结果为深入探讨宫颈癌发病机制打下基础,并为宫颈癌的治疗提供新的治疗靶点。研究方法:(1)细胞培养方法,用于HeLa、SiHa细胞的体外培养实验;(2)生物信息学方法,用于miR-182可能靶基因的分析预测;(3)荧光素酶报告基因方法,用于miR-182靶向抑制APC的验证实验;(4)miR-182 mimic/inhibitor瞬时转染方法,用于miR-182效应实验;(5)CCK-8检测方法,用于观察肿瘤细胞生存或增殖活力的实验;(6)平板克隆检测方法,用于观察肿瘤细胞克隆生长和形成的实验;(7)qPCR方法,用于定量检测相关mRNA水平的实验;(8)Western blot方法:用于定量检测相关蛋白表达的实验;(9)统计学t检验方法,用于实验组和对照组比较的显著性差异检验。研究结果:第一部分上调/抑制miR-182表达水平对宫颈癌细胞增殖的影响1.应用miR-182 mimic和miR-182 inhibitor对HeLa、SiHa细胞瞬时转染,结果显示:miR-182 mimic组内,HeLa细胞miR-182水平上调87倍,SiHa细胞上调456倍;miR-182 inhibitor组内,HeLa细胞miR-182水平下调40%,SiHa细胞miR-182水平下调96%。2.采用CCK-8方法检测细胞增殖活力实验,结果显示:miR-182 mimic组HeLa和SiHa细胞增殖活力比对照组升高,分别上升25.4%和48.8%;miR-182 inhibitor组,HeLa和SiHa细胞活性明显减低,分别下降57.5%和14.9%。3.平板克隆方法观察克隆生长实验,结果显示:miR-182 mimic组的HeLa和SiHa克隆形成数,比对照组均显著升高(HeLa,434±29 vs 304±33,P<0.01;SiHa,365±9 vs 237±6,P<0.01);miR-182 inhibitor组,HeLa和SiHa克隆形成数,比对照组显著下降(HeLa,168±24 vs 233±29,P<0.05;SiHa,172±25 vs 231±26,P<0.05)。该结果表明,miR-182能够促进人宫颈癌细胞(HeLa、SiHa细胞)的增殖能力。第二部分miR-182靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路分子APC(生物信息学分析和双荧光素酶报告基因验证)1.首先应用Target Scan软件对miR-182的潜在靶基因和功能进行预测,分析结果显示miR-182与Wnt/β-catenin信号通路(与多种干细胞和肿瘤细胞增殖均密切相关的调控信号)关键分子APC 3’-UTR区存在互补结合序列;2.在NCI-60网站预测60种细胞中miR-182与APC分子的转录水平存在负相关(P=0.013,r=-0.323),提示APC可能是miR-182负向调节的潜在靶基因。3.采用qPCR定量检测方法,在验证APC mRNA扩增的特异性条件下,结果显示miR-182 mimic组与对照组比较其APC表达水平显著下调85%。4.应用双荧光素酶报告基因方法,验证miR-182对于APC翻译水平的影响。结果显示,与对照组相比,24小时组miR-182 mimic引起APC表达下调76.6%,48小时组miR-182 mimic引起APC表达下调30.3%。该部分实验结果表明,miR-182能够靶向抑制APC表达,初步验证了APC是miR-182负向调节的靶基因。第三部分改变miR-182表达水平对Wnt/β-catenin信号通路下游分子的效应采用qPCR和Western blot方法,进一步观察miR-182对于CCND1和MYC表达影响。1.在miR-182过表达组内,qPCR显示HeLa细胞CCND1升高32倍,MYC升高10倍;SiHa细胞CCND1升高2倍,MYC升高2倍;Western Blot显示HeLa和SiHa细胞中miR-182 mimic组CCND1和MYC蛋白表达水平均增加。2.在miR-182降低组内,qPCR显示HeLa细胞CCND1水平下降97%,MYC水平下降96%;SiHa细胞CCND1水平下降83%,MYC水平下降50%。Western Blot显示HeLa和SiHa细胞中miR-182 inhibitor组CCND1和MYC蛋白表达水平均降低。该结果表明miR-182上调CCND1和MYC表达,可能通过诱导Wnt/β-catenin信号异常激活和促进宫颈癌细胞增殖。初步结论:本研究证明了miR-182能够增加宫颈癌细胞(HeLa和SiHa细胞)增殖活力和克隆形成能力,并初步揭示了miR-182通过靶向抑制APC表达,导致Wnt/β-catenin信号通路异常激活和宫颈癌细胞活跃增殖的作用机制。本研究结果为深入探讨宫颈癌发病机制打下基础。