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目的正常上皮细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离粘附后,发生的程序化细胞死亡称为失巢凋亡。研究发现许多肿瘤细胞,包括胃癌细胞具有抵抗失巢凋亡的能力,进而通过血液及淋巴转移至远处器官进行异位定植。但胃癌细胞发生失巢凋亡抵抗的分子机制还尚不明确。分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)在胃癌等多种恶性肿瘤组织中呈低表达或表达缺失。研究发现SFRP1基因启动子区甲基化导致基因表达沉默,促进胃癌的形成和发展,但SFRP1表达沉默在胃癌发展中具体机制仍不十分明确。SFRP1表达沉默是否在正常胃粘膜上皮细胞癌变中发挥作用尚未见报道。我们在前期研究中发现人胃粘膜上皮细胞GES-1(Gastric mucosal Epithelial Cells-1,GES-1)为失巢凋亡敏感细胞,本研究通过RNA干扰沉默GES-1细胞中SFRP1表达,检测细胞失巢凋亡,非锚定生长及迁移侵袭能力的变化,探讨SFRP1对GES-1细胞失巢凋亡敏感性的影响,并进一步研究了SFRP1调控胃粘膜上皮细胞失巢凋亡的分子机制,为研究SFRP1在胃癌发展中的作用及机制提供新的思路和理论依据。方法1.应用SFRP1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人胃粘膜上皮细胞GES-1后,分别应用实时定量RT-PCR和Western blot检测SFRP1 mRNA和蛋白表达,筛选出沉默效应最显著的siRNA。2.应用poly-HEMA悬浮培养细胞模拟失巢环境。3.应用流式细胞术和Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测转染SFRP1siRNA对细胞失巢凋亡的影响。4.应用软琼脂集落形成实验检测转染SFRP1siRNA对细胞非锚定生长的影响。5.应用Transwell小室实验检测转染SFRP1siRNA后细胞迁移力和侵袭力的变化。6.应用细胞免疫荧光和Western blot实验检测转染SFRP1siRNA后Wnt通路中β-catenin的定位及表达变化。7.应用实时定量RT-PCR检测转染SFRP1siRNA后β-catenin下游靶基因c-Myc和CyclinD1 mRNA表达变化。结果1.实时定量RT-PCR和Western blot结果表明,三组SFRP1 siRNA及对照组Control siRNA分别转染GES-1细胞后,siRNA-891组SFRP1 mRNA表达较对照组显著降低(P<0.01)。SFRP1蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05)。2.流式细胞术检测结果表明,悬浮培养24 h后,siRNA-891组细胞失巢凋亡率较对照组明显降低(P<0.05)。Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测表明,与对照组比较,siRNA-891组EthD-1荧光染色的失巢凋亡细胞数目明显减少,Calcein AM荧光染色的存活细胞数目明显增多,荧光值分析显示siRNA-891组较对照组有显著差异(P<0.05)。3.软琼脂集落形成实验检测表明,siRNA-891组细胞与对照组比较,所形成的集落明显变大,集落数量明显增多,两组差异有统计学意义(P<0.05)。4.Transwell小室检测显示,与对照组相比,siRNA-891组细胞迁移及侵袭能力显著增强(P<0.05)。5.细胞免疫荧光结果显示,与对照组比较,siRNA-891组β-catenin在细胞核中表达增强。Western blot结果表明siRNA-891组β-catenin蛋白表达水平较对照组明显增加(P<0.05)。6.实时定量RT-PCR结果表明,与对照组相比,siRNA-891组细胞中c-Myc mRNA和CyclinD1 mRNA表达显著增高(P<0.01)。结论SFRP1基因沉默可抑制GES-1细胞失巢凋亡,诱导其获得失巢凋亡抗性,激活Wnt分子通路可能是其机制之一。