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枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属中的一种,为革兰氏阳性菌,细胞壁不含内毒素,能形成芽孢,被FDA认为是安全菌株(GRAS),可以代谢多种糖,能够合成多种蛋白酶并能把它们分泌到细胞外。对该菌株的研究多集中在其α-淀粉酶和中性蛋白酶上。丙氨酸,一种脂肪族的非极性氨基酸,是哺乳动物非必需氨基酸,在生物体的代谢中有重要的作用,在食品工业和医药上都具有重要意义。本研究旨在敲除B. subtilis IBL23染色体上丙氨酸合成的支路代谢基因L-乳酸脱氢酶(ldh),研究ldh基因的缺失对丙氨酸产量的影响。本文还对葡萄糖对丙氨酸产量的影响做了一些探讨。以B.subtilis IBL23基因组DNA为模板,PCR扩增得到ldh基因,将ldh基因连接到载体pTG19-T上,在大肠杆菌IBL15中转化,蓝白筛选得到重组质粒pTG19-T然后以质粒pKD3为模板,PCR扩增得到cm基因,将cm基因用Nde I和EcoRV双酶切后连接到重组质粒pTG19-T-ldh上,在大肠杆菌IBL15中转化,通过氯霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19-T-ldh::cm。通过Spizizen法把pTG19-T-ldh::cm在IBL23中转化,成功敲除IBL23染色体上的ldh基因,获得了L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23△ldh。IBL23和IBL23△ldh在形态方面的区别是：IBL23△ldh中有的菌为椭圆形,而IBL23中多为杆状。这两株菌在LB培养基中培养72小时,IBL23培养36小时后菌浓达到最高,此时OD600为4.62±0.23;培养48小时后菌浓降低,此时OD600为3.70±0.03。IBL23△ldh培养12小时后茵浓达到最高,此时OD600为4.45±0.07,72小时后茵浓降低,此时OD600为1.36±0.10。IBL23培养72小时后pH为9.44±0.01,而此时IBL23△ldh的pH为9.71±0.01。敲除ldh基因后可以使丙氨酸产量提高2.43倍,IBL23△ldh发酵72小时丙氨酸产量达0.212g/L,而此时IBL23中丙氨酸的产量为0.087g/L。葡萄糖对丙氨酸产量影响的实验中发现添加20g/L葡萄糖72小时后IBL23的丙氨酸产量提高了1.5倍,由不加葡萄糖的0.094g/L变为添加葡萄糖的0.143g/L。添加葡萄糖72小时后IBL23△ldh的丙氨酸产量提高了3.3倍,丙氨酸产量由不加葡萄糖的0.204g/L变为加葡萄糖的0.674g/L。