目的:众所周知,白色脂肪组织是机体储存能量的器官。近年来随着脂肪因子的发现,脂肪组织还具有了内分泌功能并参与调节包括免疫和炎症在内的多种生理和病理过程。脂肪组织可产生和释放多种类激素样的脂肪因子,包括:瘦素、脂联素(adiponectin)、抵抗素及其它细胞因子和化学因子,如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞化学趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等,关于他们的生理学作用目前尚不明了。脂联素在人和小鼠都是含量最丰富的一种脂肪因子。人脂联素由244个氨基酸组成,脂联素的一级结构包含一个有22个胶原蛋白重复延伸区组成的氨基端和半球状区组成的羧基端,此球形区域有一段与C1q非常类似的序列,可能参与脂联素与巨噬细胞表面的C1q受体结合,影响脂质合成与机体代谢。现已明确,脂联素具有调节机体能量代谢,提高胰岛素的敏感性,抑制动脉粥样硬化等多种生理作用。另外,在许多炎症条件下脂联素水平发生变化,使人们意识到脂联素与炎症反应之间可能具有相关性。研究发现,脂联素可抑制巨噬细胞的吞噬活性和TNF-α的生成及TNF-αmRNA的表达,升高骨髓细胞抗炎因子IL-10和IL-1RA的表达而起到调节机体炎症反应的作用。脂联素的抗炎作用使人们联想到脂联素与肝脏炎症之间的可能关系。脂联素是否对病毒性肝炎也具有保护作用呢?目前尚缺乏系统、全面地研究。病毒性肝炎的主要致病机理就是活化的T细胞产生以TNF-α为主的细胞因子介导对肝细胞的免疫性损伤。刀豆蛋白A (Concanavalin A, ConA)是T细胞的有丝分裂原,注射到体内后特异性地集中在肝脏,通过激活T细胞引发一系列的免疫反应,多种细胞因子,尤其是TNF-α在ConA诱导的肝损伤中起关键作用。其病理生理特点与人急性肝炎相似。因此,本文采用ConA诱导小鼠制造急性肝损伤模型,应用脂联素干预实验全面、系统地探讨了脂联素对急性肝损伤的保护机制,包括脂联素对TNF-α、白介素-10(interleukin-10,IL-10)等多种炎症细胞因子的影响;脂联素对肝细联素是机体产生的一种生理性的脂肪因子,研究脂联素对急性肝损伤的保护作用,可为脂联素应用于肝炎的临床治疗提供理论依据,为病毒性肝炎等肝损伤的治疗提供一条安全、有效的新途径。方法1急性肝损伤模型的建立及脂联素的表达健康雄性BALB/c小鼠21只,4周龄,体重20±3g,购自河北医科大学动物实验中心。用标准饲料喂养一周后,用随机数字表随机分为3组。ConA组8只:ConA 30mg/kg尾静脉注射。对照组8只:尾静脉注射生理盐水10ml/kg。脂联素组5只:在静脉注射ConA前12小时和2小时前,分别应用脂联素3mg/kg腹膜内注射(其余两组同时给与相当毫升的生理盐水腹膜内注射)。实验小鼠在注射ConA前12小时开始禁食。注射ConA后8小时股动脉放血处死小鼠,离心血液留取血清,-20℃冰箱保存,用于血清学检测;取部分肝组织立即10%的福尔马林固定,酒精梯度脱水,二甲苯透明浸蜡后,将标本石蜡包埋制成蜡块后联续切片,用于免疫组化检测或常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,进行普通病理学观察;部分肝组织液氮冷冻,存于-80oC冰箱用于mRNA检测。采用酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清脂联素水平;采用免疫组化法检测肝组织脂联素蛋白的表达;采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肝组织脂联素mRNA的表达。2脂联素对Con A诱导的急性肝损伤细胞因子的调节作用脂联素干预模型的建立和标本的制备同第一部分。本研究检测了各组小鼠细胞因子的血清水平及部分细胞因子mRNA在肝组织的表达。采用速率法测定各组小鼠ALT的血清水平;采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测各组小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-4、INF-γ的水平。采用逆转录-聚合酶链反应检测肝组织TNF-αmRNA、IL-10 mRNA表达。3脂联素对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响脂联素干预模型的建立和标本的制备同第一部分。脂联素对ConA诱导的肝细胞凋亡是促进还是抑制?本文采用TdT介导的脱氧核苷酸切口末端标记法(TdT-mediated x-dUTP nick end labeling,TUNEL)原位检测各组小鼠肝细胞凋亡的形态特征和分布,并应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测肝细胞凋亡及细胞增殖周期。4脂联素抗炎作用信号转导通路的初步探讨脂联素干预模型的建立和标本的制备同第一部分。脂联素发挥抗炎作用的信号转导机制目前尚不明确,本文采用免疫组化法检测了各组小鼠肝组织cAMP依赖的蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase,PKA)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)蛋白的表达;RT-PCR法检测肝组织PKA mRNA和PI3K mRNA表达;NF-κB活性的检测采用凝胶电泳迁移率改变分析法(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)。结果1急性肝损伤模型的建立及脂联素的表达①普通病理观察光镜下,对照组小鼠肝组织无炎症细胞浸润。ConA组可见肝内大量T淋巴细胞浸润,在汇管区尤为明显,肝窦内红细胞淤积,中央静脉周围肝细胞水肿明显,可见点、灶状坏死区。脂联素组肝组织炎症细胞浸润明显减轻,无明显淤血,肝细胞轻度水肿。②血清脂联素的检测结果:脂联素组血浆脂联素水平(15.4±3.0μg/ml)与对照组(16.5±2.8μg/ml)比较无差异(P>0.05),与ConA组(11.8±2.1μg/ml)比较明显升高(P<0.05)。ConA组与对照组比较显著降低(P<0.05)。③肝组织脂联素蛋白的表达:对照组小鼠肝组织脂联素蛋白少量表达在中央静脉内皮细胞。ConA组肝组织脂联素蛋白表达明显增强,尤以炎症细胞浸润区为著。脂联素组表达轻度增强,见于炎症细胞浸润区及部分肝窦内皮细胞。统计分析显示:脂联素组脂联素蛋白表达(5.39±1.72%)与对照组(1.82±0.36%)比较表达增强(p<0.05),与ConA组(10.63±4.35%)比较表达下降(p<0.01);ConA组脂联素蛋白表达与对照组比较明显增强(p<0.01)。④肝组织脂联素mRNA的表达:对照组小鼠肝组织即可检测到少量脂联素mRNA表达,脂联素组和ConA组表达均增强。统计分析示:脂联素组脂联素mRNA表达(0.46±0.17)与对照组(0.23±0.05)比较表达增强(p<0.05),与ConA组(0.51±0.21)比较表达无差异(p>0.05);ConA组脂联素mRNA表达与对照组比较明显增强(p<0.01)。2脂联素对Con A诱导的急性肝损伤细胞因子的调节作用①各组小鼠血清ALT水平:对照组血清ALT水平(44.71±21.29 U/L)最低,其次为脂联素组(192.50±45.87U/L),Con A组ALT水平最高(616.00±171.50 U /L);统计分析示:脂联素组血清ALT水平与对照组比较明显升高(p<0.05),与ConA组比较明显下降(p<0.01);ConA组与对照组比较明显升高(p<0.01)。②各组小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-4、INF-γ的变化:对照组、脂联素组和Con A组血清TNF-α水平分别为:0.06±0.04 ng/ml,0.51±0.29 ng/ml,0.92±0.37 ng/ml;IL-10血清水平分别为:0.09±0.06 ng/ml,0.54±0.17 ng/ml,0.26±0.11 ng/ml;IL-4血清水平分别为0.08±0.03 ng/ml,0.27±0.11 ng/ml,0.69±0.25 ng/ml;INF-γ血清水平分别为:0.71±0.28 ng/ml,2.24±0.46 ng/ml,2.97±0.61 ng/ml;对照组4种细胞因子水平均低于脂联素组和Con A组,脂联素组IL-10血清水平高于Con A组(p<0.05),其余3种细胞因子均低于Con A组。③相关分析显示:血清ALT水平分别与血清TNF-α、IL-4、INF-γ水平呈正相关(r:0.738 p<0.01; r: 0.693 p<0.01; r:0.637 p<0.01)。④肝组织TNF-αmRNA的表达:对照组微量表达(0.13±0.07),Con A组表达(0.82±0.27)较对照组明显增强(p<0.01),脂联素组表达(0.51±0.19)较对照组增强(p<0.01);脂联素组较Con A组表达下降(p<0.05)⑤肝组织IL-10 mRNA的表达:对照组微量表达(0.21±0.11),脂联素组(0.74±0.27)较对照组表达明显增强(p<0.01);Con A组(0.43±0.19)较对照组表达增强(p<0.05),脂联素组较Con A组表达增强(p<0.05)。3脂联素对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响①经TUNEL染色和流式细胞术分析对肝细胞凋亡检测结果显示: ConA组肝细胞凋亡率最高(25.96±0.65%),脂联素组次之(5.21±0.32%),对照组最低(4.96±0.23%)。统计分析显示:脂联素组肝细胞凋亡率明显低于ConA组(p<0.01),与对照组之间无差异(p>0.05),ConA组明显高于对照组(p<0.01)。②各组肝细胞增殖周期分布:对照组、脂联素组、ConA组小鼠肝细胞增殖G0/G1期比率分别为:36.82±3.1%,46.73±4.6%,52.70±5.9%;S期比率分别为48.83±3.6%,37.47±4.1%,32.15±4.6%;G2/M期比率分别为:15.35±1.4%,16.38±1.8%,15.30±1.3%。统计分析显示:ConA组肝细胞与对照组比较G0/G1期比例增加( p<0.01),S期比例下降( p<0.01),G2/M期与对照无差异。脂联素组与ConA组比较G0/G1期比例下降( p<0.05),S期比例升高(p<0.05),G2/M期两组间无差异。脂联素组与对照组比较G0/G1期比例增加( p<0.01),S期比例下降( p<0.01),G2/M期与对照组无差异。4脂联素抗炎作用信号转导通路的初步探讨①肝组织PI3K蛋白的表达:对照组小鼠肝细胞PI3K蛋白表达阳性,主要表达在细胞膜,散在分布。ConA组和脂联素组肝组织PI3K蛋白表达增强,细胞浆和细胞膜均表达,主要分布于中央静脉周围。脂联素组(53.83±20.78%)较ConA组(32.75±14.97%)和对照组(10.85±5.43%)表达增加(p<0.05)( p<0.01);ConA组较对照组表达增强( p<0.01)。②肝组织PKA蛋白的表达:对照组小鼠肝细胞PKA蛋白表达阳性,主要表达在细胞膜,散在分布。ConA组和脂联素组肝组织PI3K蛋白表达均增强,细胞浆和细胞膜均有表达,主要分布于中央静脉周围。脂联素组(80.33±30.35%)较ConA组表达(87.69±25.86%)无差异(p>0.05),两组表达均高于对照组(12.48±8.87%)增强(p<0.01)。③肝组织PKA mRNA的表达:对照组(1.19±0.43)、脂联素组(1.04±0.11)、ConA组(1.41±0.66)小鼠肝组织均有PKA mRNA的较强表达,三组之间比较无差异(p>0.05)。④肝组织PI3K mRNA的表达:对照组肝组织有PI3K mRNA的微量表达(0.36±0.12),脂联素组(0.54±0.13)较对照组和Con A组(0.39±0.09)表达均明显增强(p<0.05)(p<0.05), Con A组表达较对照组无差异(p>0.05)。⑤小鼠肝组织NF-κB活性检测结果:对照组、脂联素组和ConA组小鼠肝组织NF-κB活性分别为:75.73±20.14,152.83±58.86,267.30±80.65。脂联素组与ConA组比较NF-κB的结合活性下降(p<0.01),较对照组升高(p<0.05);ConA组明显高于对照组(p<0.01)。⑥小鼠肝组织NF-κB结合活性与血清ALT(r=0.823,p<0.01)、TNF-а水平(r=0.793,p<0.01)呈正相关。结论1.小鼠静脉注射ConA可导致肝脏急性炎症,血清脂联素水平降低,这与注射ConA后产生的大量炎症细胞因子抑制脂肪组织分泌脂联素有关。但肝组织脂联素蛋白及其mRNA的表达增强,这与肝组织内炎症细胞的浸润及机体所产生的抗炎机制有关。如静脉注射ConA前补充外源性脂联素,可明显减轻炎症,表明脂联素可减轻ConA诱导的肝组织炎症程度,但对其mRNA在肝组织的表达无明显影响。2小鼠静脉注射ConA可升高血清ALT以及IL-4、TNF-α、IL-10和IFN-γ多种细胞因子血清水平。预先应用重组脂联素干预可降低ALT血清水平以及促炎细胞因子IL-4、TNF-α和IFN-γ的血清水平,但升高抗炎因子IL-10的血清水平及其在肝脏的表达,即脂联素通过促进抗炎因子、抑制促炎因子的产生来降低升高的血清ALT水平。3注射ConA可诱导小鼠肝细胞凋亡并抑制肝细胞再生。脂联素可改善ConA对肝细胞增殖的抑制作用并明显降低肝细胞的凋亡率,从而起到保护肝细胞的作用。4注射ConA后小鼠肝组织PI3K和PKA蛋白表达以及NF-κB的结合活性增强,补充外源性脂联素可进一步增强PI3K的蛋白及mRNA的表达,降低NF-κB的活性,而PKA表达无变化。脂联素通过PI3K/Akt信号途径的激活,降低NF-κB结合活性,从而发挥抗炎作用。