猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneuminiae,Mhp)是猪支原体肺炎的病原体。P46基因是编码猪肺炎支原体膜蛋白P46的基因片段,P46膜蛋白被认为是Mhp的特异性表面蛋白。本研究根据已报道的序列,设计了一对带有BAMHI和HINDⅢ酶切位点的引物,利用PCR从Mhp野毒株MY-99扩增出了P46基因,经克隆测序,该基因序列全长1134bp,编码378个氨基酸,预计其表达的蛋白分子量为41.49KDa,PI值为5.97。该基因序列中含有3个TGA编码Trp,将MY-99株的P46基因与Mhp国际标准株232株、J株和7446株比较其的同源性达到99%,且其编码氨基酸的同源性也达99%以上。P46基因经过克隆,通过设计的引物进行定点突变,利用引物分别针对3个位点的TGA进行修饰,通过测序验证,我们成功地对MY-99株的基因进行了改造,将182、381和734位的A突变G,并将T载体内的P46基因亚克隆嵌入表达载体pet-32a(+),构建了pet-32a(+)-P46重组质粒。将重组质粒转化进表达菌rosetta,得到重组表达菌Ro-CTB600。在IPTG的诱导下,P46蛋白在重组表达菌中获得了融合表达,得到了融合蛋白Trx-P46。通过SDS-PAGE分离纯化表达的融合蛋白Trx-P46产物检测证实,重组表达的Mhp-MY-99株的P46为融合蛋白,其大小与预测的分子量相同为61.79KDa(其重组质粒中由TrxA及其它附加序列编码蛋白的分子量约为20.3 KDa,表达的P46蛋白约为41 KDa)。采用Western-Blotting法,用抗猪肺炎支原体的阳性血清对其表达的融合蛋白进行检测,发现该重组的Trx-P46融合蛋白能与抗Mhp阳性血清发生反应,结果表明P46蛋白已表达。本研究经PCR扩增、克隆和表达,最终获得了Mhp的融合蛋白Trx-P46,为Mhp的实验室检测和基因工程疫苗的研制奠定了基础。