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本文从以下两部分进行了阐述: 第一部分: 脱氢酶/还原酶SDR家族成员9(DHRS9)属于短链脱氢酶/还原酶家族,是一种3α-羟化甾类脱氢酶,将双氢睾酮(DHT)还原为3α-雄烷二醇,将双氢孕酮还原为3α-四氢孕酮。可能催化视黄酸从视黄醛的合成,但对视黄醇无催化作用。其辅酶为NAD(H)。脱氢酶/还原酶SDR家族成员7(DHRS7),将无活性可的松转化为其活性形式氢化可的松,将雄烯二酮转化为睾酮,将视黄醛转化为视黄醇。其辅酶为NADH和NADPH。这两种蛋白在不同的生物化学途径起十分重要的作用,包括中间代谢和外源物质生物转化。作为与前列腺癌相关组织DHT代谢的酶,DHRS9是前列腺癌治疗的潜在靶点。为了阐明DHRS9和DHRS7催化活性的结构基础,将两者在不同的表达系统表达,并优化表达水平和纯度。由于两者蛋白的疏水性,去垢剂在维持其结构中是必不可少的。 第二部分: DNA聚合酶参与DNA合成,并作为一种试剂广泛应用于分子生物学技术中,如DNA测序和基因扩增。本论文中将嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶的大片段部分(Bst-LF)纯化、结晶,并尝试解析结构。为强化BstDNA聚合酶在测序中的敏感度和测序过程的实时监控,荧光标记的底物被引入这一领域。研究发现Bst-LF利用Mg离子催化DNA合成反应效率较低,而结合Mn离子后容易催化DNA合成反应。然而,Mn离子氧化还原作用可与探针发生反应,所以Mn离子并不是一个理想的辅助离子。我们期望对Bst DNA聚合酶进行蛋白质工程改造,使之能够在结合Mg离子的状态下高效地催化荧光标记的底物dNTP掺入延伸反应。为实现这一目的,我们将利用结构生物学解析得到Bst-LF分别在Mg离子和Mn离子存在时与荧光探针结合的精细结构,利用两种 金属离子结合态的差异发现Mg结合态Bst-LF难以催化反应的分子机制,从而通过蛋白质工程对改善Mg结合态Bst-LF利用荧光标记底物催化DNA聚合反应的效率。通过以上研究,我们希望能够利用分子进化的方法获得理想的用于第三代测序——单分子实时测序的Bst DNA聚合酶。