论文部分内容阅读
女性压力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence,SUI）是一种常见疾病,其发生率随妇女年龄的增加而增加,影响妇女的生活质量和身心健康。SUI发生的主要原因是尿道高移动性和尿道括约肌功能障碍。女性SUI的治疗方法虽多,但均难从根本上纠正尿道括约肌功能障碍。本课题拟利用基因工程技术将生肌调节因子Myocardin基因转染人脐血间充质干细胞（UB-MSCs）,并移植于SUI模型大鼠尿道括约肌周围,研究基因调控的UB-MSCs是否具有向平滑肌细胞分化的能力以及其在尿道括约肌周围存活、分布情况和对尿道括约肌功能的影响,为细胞移植治疗SUI提供理论依据。主要实验结果和结论如下:1.采用密度梯度离心法从脐血中分离培养出间充质干细胞（UB-MSCs）,并通过流式细胞仪对其表面抗原进行鉴定。UB-MSCs均稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45,这与源于骨髓MSCs的表面抗原标记相一致。2.构建了真核表达质粒载体pEGFP-Myocl。以pAdApt.Myocl为模板进行PCR和琼脂凝胶电泳,切胶回收纯化;反应产物经KpnⅠ和AgeⅠ双酶切后与线性化的载体用T4 DNA连接酶连接,形成pEGFP-Myocl,将之转入工程菌JM109,铺板,挑选阳性克隆,摇菌,提取质粒。目的片段测序分析,与Gene Bank报道序列完全一致。3.应用脂质体转染的方法,将pEGFP-Myocl转入UB-MSCs中。转染后的细胞经G418筛选,转染效率为15.3%。转染后的MSCs用RT-PCR可检测出Myocardin的表达;荧光显微镜下观察可见胞体内有报告基因产物的绿色荧光;免疫组化检测Myocardin以及其下游蛋白myosin表达为阳性,而对照组为阴性表达。这说明UB-MSCs在Myocardin的调控下可诱导为成平滑肌细胞。4.通过模拟产伤和卵巢切除成功制作SUI大鼠动物模型。对模型大鼠进行尿动力学检测,最大膀胱容量和漏点压均明显低于正常;HE染色可见近端尿道括约肌萎缩,肌纤维有断裂。5.将转染Myocardin基因的UB-MSCs扩增后局部植入模型鼠尿道括约肌周围,通过Brdu法观察发现其可在注射点附近短时生长,并表达肌相关蛋白Desmin;通过尿动力学指标的统计分析,细胞移植后SUI模型鼠的控尿功能可以得到改善,但此效应是移植细胞对损伤的修复还是单纯的填充效应,还需进一步研究。总之,本实验成功地构建了质粒载体pEGFP-Myocl,并将其成功地转染人UB-MSCs,使MSCs在Myocardin的调控下分化为成平滑肌细胞;并观察了向平滑肌分化的MSCs对SUI模型大鼠的尿道括约肌周围的分布、分化与生存情况以及对尿道括约肌功能的影响,初步探讨了细胞移植治疗SUI的可行性。本实验为SUI治疗的基础研究,旨在为SUI治疗提供新的思路。