论文部分内容阅读
传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）是传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）的病原,可特异性攻击法氏囊B淋巴细胞而引发青年鸡的接触性、免疫抑制性传染病。近年来,IBDV流行毒株出现基因重排、基因重组、抗原变异等新特点,给IBD的防制工作带来了新的挑战。因此,持续跟踪IBDV毒株的分子流行情况、深入探究病毒与宿主之间的相互作用将为我们深入掌握毒株的流行趋势、解析毒株分子致病机制奠定基础,并为研发有效的IBD防控措施提供可靠的科学依据。研究首先通过基于IBDV-VP2高变区（vVP2）的RT-PCR技术对2019年采集自广西桂林地区的IBD疑似法氏囊组织进行检测,并通过v VP2的序列特征选择4个样品进行IBDV的分离和v VP2、VP1-b的序列分析。结果显示,分离株GL1902与SHG352、SHG19等新型抗原变异株v VP2基因的核苷酸相似性最高为94.1%-96.6%,v VP2特征性氨基酸位点与SHG19等新型变异株一致,在进化树中GL1902与SHG19、SHG382等新型变异株同属一个分支;3株分离株GL1906、GL1909、GL19010的v VP2基因的核苷酸相似性与UK661、HLJ-0504、NN1172等超强毒株（vv IBDV）相似性最高为95.0%-99.6%,在222、256、284、294、299位特征性氨基酸位点与vv IBDV参考株相同,而279N与致弱毒株相同,进化树中也与vv IBDV HLJ-0504、NN1172等同属一支;而基于VP1-b基因的研究中2株分离株GL1902、GL1909与SHG19等新型抗原变异株的核苷酸相似性最高为95.7%-96.5%,特征性氨基酸位点242D、287T、390L、393E与SHG19等新型变异株一致,进化树中与SHG19、SHG382等新型变异株同属一个分支;另2株分离株GL1906、GL19010与HLJ-0504、NN1172等vv IBDV的核苷酸相似性最高为88.1%-99.1%,在242D、287A、390L、393E与重排株如NN1172、HLJ-0504相同,进化树的分析中与HLJ-0504等参考株形成一个独特分支。表明GL1902为基因型为A2d B1b的新型变异株;GL1906、GL1910为基因型为A3B3的超强毒株;GL1909为基因型为A3B1b的重排类型的新型变异株。其次,研究探究了vvIBDV感染对鸡干扰素调节因子（IRF7）的调控作用。试验利用DF-1细胞,首先分析了病毒与IRF7信号通路之间的相互联系。结果,IBDV在感染后前18 hpi,IRF7和IFN-βm RNA水平明显上调,在18 hpi后IRF7和IFN-βm RNA水平开始轻微下调,而病毒复制水平持续上升并维持到24 hpi,并表现为病毒感染剂量越高,IRF7和IFN-βm RNA水平越低,表明IBDV感染后对IRF7 m RNA表达的抑制与病毒感染剂量有关;Western blotting检测证实IBDV感染后18 hpi促进IRF7的降解,但与病毒剂量无关。进一步研究发现,IBDV感染细胞的IRF7二聚化水平显著低于未感染对照组（P＜0.05）,蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后再感染IBDV发现,IRF7的表达量显著高于未处理组（P＜0.01）,表明IBDV通过蛋白酶体途径促进IRF7的降解。将IBDV感染IRF7过表达的DF-1细胞,QPCR检测结果表明,IBDV复制水平低于空质粒转染的对照组,并且发现18 hpi之后IRF7蛋白表达量仍然会下降,36 hpi IRF7的表达量最低。最后,研究将IBDV VP3蛋白的真核表达质粒转染DF-1细胞后,探讨IBDV VP3蛋白对细胞IRF7和IFN-β信号通路的影响。结果显示,在100 TCID50NDV刺激下,转染p3×Flag-CMV14-VP3质粒后,IRF7和IFN-β的m RNA水平及蛋白表达量显著低于空载体转染组,同时IBDV VP3作用影响IRF7蛋白的二聚化水平,转染p3×Flag-CMV14-VP3质粒后经Poly（I:C）刺激的细胞中二聚化的IRF7蛋白量显著减少。在Poly（I:C）刺激的细胞中,转染p3×Flag-CMV14-VP3质粒的细胞经蛋白酶体抑制剂MG132处理后,IRF7蛋白表达量高于未处理组,表明IBDV VP3蛋白能通过蛋白酶体途径促进IRF7的降解。综上所述,本研究从广西桂林地区分离出4株IBDV毒株,基因序列分析得出GL1902为基因型为A2d B1b的新型变异株;GL1906、GL1910为基因型为A3B3的超强毒株;GL1909为基因型为A3B1b的重排类型新型变异株。vv IBDV对IRF7的调节表现为先激活后抑制的过程,从而影响下游IFN-β的表达进而影响细胞的抗病毒效应,IBDV的VP3蛋白参与了对IRF7的调控作用。IBDV及其VP3蛋白通过蛋白酶体途径影响IRF7和IFN-β的转录水平及蛋白表达水平,IBDV浓度越高,IRF7和IFN-β的m RNA表达量越少,同时IBDV及其VP3蛋白作用使IRF7蛋白的二聚化水平降低,在IBDV感染的细胞中转染IRF7质粒,IBDV的复制减少,在病毒感染后期IBDV也会引起细胞中IRF7蛋白表达量的减少。以上实验结果拓宽了对于IBDV流行特征及分子致病机制的理解,为IBD的防治提供科学依据。