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第一部分室旁核中血管紧张素II和AT1受体在肾血管性高血压大鼠心交感传入反射增强机制中的作用背景交感神经系统活动过度激活是高血压病的重要特征,在高血压病的病程进展和并发症的发生中起主要作用。抑制高血压病过度增强的交感神经活动已成为近年来治疗高血压病的重要策略。心交感传入反射(cardiac sympathetic afferent reflex,CSAR)是一种交感兴奋性反射,在心室表面应用辣椒素、缓激肽、腺苷等刺激心交感传入神经末梢均可引起CSAR,导致交感神经兴奋和血压升高。我们以前的研究表明两肾一夹(two kidney-one clip,2K1C)肾血管性高血压大鼠CSAR病理性增强,但其CSAR增强的机制尚不清楚。中枢血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)是CSAR的一个重要的信号分子,室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是整合交感神经活动和心血管活动的重要核团,含有高密度的血管紧张素1型受体(AT1受体),其发出的神经纤维投射到胸腰段脊髓中间外侧柱和延髓头端腹侧区(RVLM),它们在调控交感神经活动和血压中起重要作用。我们推测PVN内Ang II和AT1受体可能参与肾血管性高血压大鼠CSAR增强效应,本研究在2K1C和假手术大鼠应用PVN微量注射Ang II和AT1受体拮抗剂losartan以及AT1受体表达测定等方法,探讨了PVN中的Ang II和AT1受体在肾血管性高血压大鼠CSAR增强机制中的作用。目的1.研究PVN内Ang II在肾血管性高血压大鼠CSAR和交感神经激活中的作用。2.探讨AT1受体在肾血管性高血压大鼠增强的CSAR和交感神经激活中的作用。方法实验用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重250-300g,清洁级,由南京医科大学实验动物中心提供。大鼠置于室温22℃,湿度30-40%环境中,自由摄食和饮水。大鼠随机分为两组,一组将右肾动脉安装内径0.2 mm的U形银夹造成肾动脉部分狭窄、左肾保持完整,制成两肾一夹(two kidney-one clip,2K1C)肾血管性高血压大鼠模型,另一组行假手术(Sham)作为对照,假手术组除不安置U形银夹外,其余操作同上。采用Powlab尾动脉测压系统(ADInstruments,Australia)监测大鼠尾动脉收缩压(systolic arterial pressure,SBP),以SBP > 160 mmHg作为肾血管性高血压的标准。术后第4周末进行急性动物实验,实验在麻醉SD大鼠上进行,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位、核团微量注射药物,利用Powerlab生物信号采集系统,在体记录基础肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity,RSNA)、平均动脉压(mean arterial pressure,MAP),以心室表面应用辣椒素引起RSNA变化的值作为评价CSAR的指标。术后过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,迅速断头取脑,液氮速冻后用冰冻切片机(Leica CM 1900-1-1,German)分别在PVN和RVLM冠状面水平做连续切片,然后用内径1 mm打孔针头取出PVN和RVLM组织,Western blotting法测定PVN和RVLM中的AT1受体蛋白表达。1. Ang II的效应2K1C组与Sham组大鼠各24只,每组均随机分为4小组,每小组6只,分别在双侧PVN内微量注射人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)(50 nl)和3种剂量的Ang II(0.03、0.3和3 nmol)。观察注射前后CSAR、基础RSNA和MAP的变化。为排除药物扩散至PVN邻近部位产生效应的可能性,另取3只大鼠,观察与PVN邻近的下丘脑前区微量注射大剂量Ang II(3 nmol)对CSAR、基础RSNA和MAP的变化的影响。2. Losartan的效应2K1C组与Sham组大鼠各28只,每组均随机分为4小组,每小组7只,分别在双侧PVN内微量注射ACSF(50 nl)、Ang I(I3 nmol)、Losartan(50 nmol)、Losartan(50 nmol)+ Ang II(3 nmol),其中Losartan+ Ang II组采用losartan预处理10 min后再注射Ang II,观察注射前后CSAR、基础RSNA和MAP的变化。3. AT1受体的表达2K1C组与Sham组大鼠各8只,过量戊巴比妥钠钠麻醉处死大鼠,迅速断头取脑,液氮速冻后保存于-70℃低温冰箱中。用冰冻切片机分别在PVN和RVLM冠状面水平做连续切片,温度维持在-10℃,然后用内径1 mm打孔针头取出PVN和RVLM。组织放置于0.1 ml RIPA lysis缓冲液中匀浆并提取总蛋白。Western blotting法测定PVN和RVLM中的AT1受体蛋白。结果1.双侧PVN微量注射Ang II引起与剂量相关的CSAR增强、基础RSNA加强和MAP什高,与Sham组相比,2K1C组微量注射Ang II引起更强的CSAR增强效应。2. 2K1C组大鼠CSAR增强,PVN微量注射losartan使2K1C组大鼠增强的CSAR恢复正常。3. PVN应用losartan预处理,消除了Ang II引起的CSAR增强、基础RSNA加强和MAP什高效应。4.与Sham组大鼠相比,2K1C组大鼠PVN和RVLM中的AT1受体表达均显著增多。结论以上结果表明PVN应用外源性Ang II增强CSAR、增加交感传出活动和升高血压,肾血管性高血压大鼠PVN对Ang II的反应增强,其作用是由AT1受体介导的。肾血管性高血压大鼠PVN和RVLM中AT1受体表达显著增加,阻断PVN中的AT1受体可使肾血管性高血压大鼠增强的CSAR恢复正常、并使动脉血压降低和交感神经活动减弱。第二部分室旁核中内皮素-1对大鼠心交感传入反射的调控及其机制研究背景心交感传入反射(cardiac sympathetic afferent reflex,CSAR)是一种交感兴奋性反射,心脏表面应用辣椒素(capsaicin)或缓激肽(BK)可刺激神经末梢,兴奋通过心交感传入神经到达中枢,经中枢整合后反射性地引起交感传出活动增强和动脉血压升高。高血压、慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是严重危害人类健康的常见病,交感神经系统活动过度增强是高血压、CHF的重要特征之一,是加速病情恶化的重要因素。高血压、CHF时CSAR的病理性增强是导致交感活动亢进的重要原因之一,在高血压、CHF发病机制中起了极其重要的作用。室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是整合交感神经活动和心血管活动的重要核团,也是控制CSAR的关键中枢部位,但PVN介导CSAR的分子机制尚不十分明确。已有研究表明PVN中的活性氧(reactive oxygen species, ROS)尤其是超氧阴离子介导CSAR;内皮素-1(endothelin-1,ET-1)激活NAD(P)H氧化酶使超氧阴离子产生增加,导致氧化应激和心血管功能障碍;侧脑室注射ET-1引起血压升高和交感活性增强,其作用是经内皮素A(ETA)受体介导的,损毁PVN可消除ET-1引起的效应。我们推测PVN中ET-1经ETA受体介导参与调控CSAR,其调节的分子机制可能与超氧阴离子有关。本研究探讨了Sprague-Dawley(SD)大鼠PVN微量注射ET-1、ETA受体阻断剂BQ-123、超氧阴离子清除剂tempol和PEG-SOD对CSAR的影响,以及测定PVN中超氧阴离子水平变化。目的1研究PVN中ET-1对CSAR的调控作用。2探讨ET-1对CSAR的调控的分子机制。方法实验用雄性SD大鼠,体重250-300g,清洁级,由南京医科大学实验动物中心提供。大鼠置于室温22℃,湿度30-40%环境中,自由摄食和饮水。在α-氯醛糖和乌拉坦麻醉下,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位、核团微量注射,利用Powerlab生物信号采集系统,在体记录基础肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity,RSNA)、平均动脉压(mean arterial pressure,MAP),以心室表面应用辣椒素(capsaicin)引起RSNA的变化值作为评价CSAR的指标。在测量超氧阴离子水平的大鼠PVN微量注射完10 min后,过量戊巴比妥钠钠麻醉处死大鼠,迅速断头取脑,液氮速冻后用冰冻切片机(Leica CM 1900-1-1,German)分别冠状面在PVN水平做连续切片,然后用内径1 mm打孔针头取出PVN组织,匀浆后低温离心(10 min,4℃,3000 rpm),取上清液用化学发光法测定超氧阴离子水平。1. ET-1的效应大鼠随机分为4组,每组6只,分别在双侧PVN微量注射人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)和3种剂量的ET-1(0.1、1和10 pmol),观察注射前后CSAR、基础RSNA和MAP的变化。2. ETA受体阻断剂BQ-123的效应大鼠随机分为4组,分别在双侧PVN微量注射ACSF(50 nl,n=6)、ET-1(10 pmol,n=6)、BQ-123(40 nmol,n=7)和BQ-123(40 nmol)+ ET-1(10 pmol,n=7),观察注射前后CSAR、基础RSNA和MAP的变化。BQ-123+ ET-1组为BQ-123预处理10 min后再注射ET-1。为排除药物扩散至PVN邻近部位产生效应的可能性,另取3只大鼠,观察在与PVN邻近的下丘脑前区微量注射大剂量ET-1(10 pmol)对CSAR的影响。3.超氧阴离子清除剂Tempol和PEG-SOD的效应大鼠随机分为6组,分别在双侧PVN微量注射ACSF(50 nl,n=6)、tempol(20 nmol,n=8)、PEG-SOD(2 U,n=8)、ACSF(50 nl)+ET-1(10 pmol,n=8)、tempol(20 nmol)+ ET-1(10 pmol,n=8)和PEG-SOD(2 U)+ET-1(10 pmol,n=8)。预处理组均采用预处理15 min后再注射ET-1,观察注射前后CSAR、基础RSNA和MAP的变化。4. ET-1和BQ-123对PVN中超氧阴离子水平的影响大鼠随机分为4组,每组7只,分别在双侧PVN微量注射ACSF(50 nl)、ET-1(10 pmol)、BQ-123(40 nmol)和BQ-123(40 nmol)+ ET-1(10 pmol),注射完10 min后迅速取PVN,用光泽精化学发光法测定超氧阴离子水平。结果1. PVN微量注射ET-1引起与剂量相关的CSAR增强、基础RSNA增加和MAP升高,而下丘脑前区微量注射ET-1对CSAR、基础RSNA和MAP均无显著影响。2. PVN微量注射ETA受体阻断剂BQ-123对CSAR、基础RSNA和MAP无显著影响,而BQ-123预处理消除ET-1引起的CSAR增强、基础RSNA增加和MAP升高效应。3. PVN微量注射超氧阴离子清除剂tempol或PEG-SOD均可以引起CSAR减弱、基础RSNA和MAP下降,tempol或PEG-SOD预处理均消除ET-1引起的CSAR增强、基础RSNA加强和MAP什高效应。4. PVN微量注射ET-1显著增加PVN中超氧阴离子的水平,BQ-123对PVN中超氧阴离子水平无显著影响,但用BQ-123预处理阻断ET-1引起的PVN中超氧阴离子水平增加效应。结论1. PVN中的ET-1增强CSAR、增加交感神经活动和动脉血压,其效应是通过ETA受体介导的。2清除PVN中的超氧阴离子减弱CSAR、降低交感神经活动和动脉血压,PVN中的超氧阴离子介导ET-1通过ETA受体引起的CSAR增强、交感神经活动增加和动脉血压升高的效应。