目的:进入21世纪,人民的生活水平及治疗技术更是登上一个新的台阶,而伴随而来的是老年病、慢性病的住院率日益增高。作为其中之一的糖尿病更显得突出,因此,对于糖尿病的科学研究在全世界都引起广泛关注。越来越多的研究支持2型糖尿病是一种“慢性低度炎症状态”的假说,众多的临床研究显示,2型糖尿病常伴有多种细胞因子浓度的改变,炎症标志物能预测2型糖尿病的发生及预后。也有实验证明抗炎治疗或者降低某些炎症因子的血清水平可明显改善2型糖尿病患者糖代谢的异常。在多种细胞因子中,较为关注的是IL-10,TNF-α。IL-10由活化的单核-巨噬细胞、淋巴细胞分泌,它能抑制细胞因子的生成,具有多方面的抗炎效应以及较强的免疫抑制作用。近年来,对于细胞因子IL-10在2型糖尿病发病机理的研究工作取得了很大进步,发现其血清水平变化与2型糖尿病发病密切相关。动物实验表明,鼠发生糖尿病时,IL-10明显降低,而注射IL-10表达质粒后,实验动物的糖尿病发生率得以降低。人体研究也发现,血清中低水平的IL-10与高血糖、高糖化血红蛋白(HbA1c)密切相关。还有类似报道认为,IL-10抑制2型糖尿病高血糖及其它炎性因子的水平,可能对于2型糖尿病的发病具有一定的保护作用。因此,2型糖尿病可能是细胞因子介导的炎症反应,但其分子和基因层次的机制尚待明确,关于IL-10基因启动子-592位点多态性与2型糖尿病相关研究的报道也较少,而且结论不一。同时,TNF-α(瘤坏死因子-α)作为一种重要的炎性因子,参与多种免疫炎症的病理过程,因此,人们推测TNF-α对于2型糖尿病的病理进展可能有促进作用。近年来,有关TNF-α在2型糖尿病并发症中的血管病变发病机制中的研究取得了很大进展。首先从血清水平,人们发现,2型糖尿病患者TNF-α血清水平显著高于正常对照组。已经有大量的实验描述了胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)的病理过程中TNF-α的作用。近年发现,动物及人的脂肪组织、肌肉组织也能分泌TNF-α,且在肥胖症和糖尿病患者的组织中含量很高。它与细胞表面的相应受体结合后,影响胰岛素受体磷酸化和激酶活性水平,干扰胰岛素受体后信号传导;抑制脂肪细胞摄取葡萄糖,使血糖、血脂代谢异常。而糖尿病最常见的并发症是糖尿病微血管、大血管病变,其具体发病机制尚未完全阐明。此后,人们又开始对TNF-α-308位基因多态性与2型糖尿病的发病进行了相关研究。自1993年首次报道TNF-α基因启动子区第308位存在G/A变异后,国内外学者就TNF-α-308位基因多态性与胰岛素抵抗(IR)及2型糖尿病的关系展开了一系列的研究,但在不同的群体中,所得研究结果不尽相同。随着分子生物学和分子遗传学的发展,目前已成功定位了多个糖尿病易感基因及基因区。同时,随着对2型糖尿病遗传机制研究的不断深入,人们发现2型糖尿病存在很大的遗传异质性,具有明显的地区与民族差异。研究不同地区、不同群体2型糖尿病的遗传易感性及相关因素成为2型糖尿病研究的热点问题。本研究拟通过对临床样本细胞因子IL-10、TNF-α血清含量的测定,分析影响2型糖尿病发病及其血管并发症的各项危险因素,以及TNF-α-308G/A,IL-10-592A/C基因多态性与糖尿病糖代谢紊乱的关系,试图为细胞因子血清水平及其基因型在2型糖尿病发病的可能机制提供一定的理论依据。方法:1细胞因子IL-10血清浓度及IL-10-592A/C基因多态性分布与2型糖尿病发病的关系224例2型糖尿病组患者(DM组)均为2008年11月-2009年4月在河北省唐山工人医院内分泌二科新入院患者,符合1999年WHO糖尿病诊断标准,排除急慢性感染、急性并发症、心血管病及恶性肿瘤和自身免疫性疾病;275例正常对照组(NC组)取自体检中心健康查体者,空腹血糖<6.1 mmo/L,且餐后2 h血糖<7.8 mmol/L,无急慢性感染,无心、肝、肺、肾等疾病史,无糖尿病家族史,无自身免疫性疾病史及长期口服药物史。以上入组研究对象知情并表示同意,彼此间无直接血缘关系、性别、年龄匹配、无其他遗传疾病。糖尿病组与对照组的年龄、性别差异无统计学意义,具有可比性。入选的2型糖尿病患者及正常对照组于次日清晨空腹抽取静脉血4ml,分别装入两个试管,一管自然凝固后,4000rpm离心10min,取上清置于-80℃冻存备用,应用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)方法测定血清中IL-10的浓度。另一管以EDTA抗凝,应用DNA提取试剂盒提取基因组DNA,并于4℃保存,以Rsa I为限制性内切酶,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphisms assay,PCR-RFLP)方法检测DNA标本IL-10启动子区-592位点基因多态性。使用SPSS13.0统计软件t检验方法比较两组间IL-10血清水平是否具有显著性差异,χ2检验比较组间基因型频率和等位基因频率。2细胞因子TNF-α血清浓度与2型糖尿病的关系以及其与2型糖尿病血管病变之间的关系本部分研究通过观察2型糖尿病组与正常对照组TNF-α血清含量的不同水平,探讨TNF-α与2型糖尿病的关系;通过观察TNF-α血清含量在2型糖尿病不同血管病变组间的差异,分析其与2型糖尿病血管并发症的关系;分析了各不同组间血脂生化指标的差异。(1)根据是否具有微血管病变,把2型糖尿病受试者分为微血管病变组(microvascular complications,MiVC)107例,非微血管病变组(Non-MiVC)117例。(2)根据是否具有大血管病变,把2型糖尿病受试者分为大血管病变组(macrovascular complications,MaVC)120例,非大血管病变组(Non-MaVC)104例。受试者于采血前夜22:00后禁食,次晨抽取肘静脉血4ml,自然凝固后4000rpm离心10min,取上清置于-80℃冻存备用,采用用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别测定TNF-α血清水平。使用SPSS13.0统计软件t检验方法比较组间TNF-α血清水平是否具有显著性差异。3 TNF-α-308G/A基因多态性分布与2型糖尿病发病的关系本部分研究通过检测TNF-α-308G/A基因多态性在2型糖尿病组与正常对照组分布的不同,探讨其与2型糖尿病发病的潜在关系。入选的2型糖尿病患者及正常查体对照组于次日清晨空腹抽取静脉血4ml,以EDTA抗凝,应用DNA提取试剂盒提取基因组DNA,并于4℃保存,以Nco I为限制性内切酶,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphisms assay,PCR-RFLP),聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA标本TNF-α启动子区-308位点基因多态性。结果:1细胞因子IL-10血清浓度及IL-10-592A/C基因多态性分布与2型糖尿病发病的关系2型糖尿病患者组IL-10血清水平为21.12±5.17 pg/mL,对照组为42.35±6.30 pg/mL,两组间差异有统计学意义(P<0.01);在2型糖尿病易感性与IL-10-592基因型频率及基因频率的分析中显示:IL-10-592基因型频率及等位基因频率在2型糖尿病组与正常对照组比较中均有显著性差异(P<0.01)。2细胞因子TNF-α血清浓度与2型糖尿病的关系以及其与血管病变之间的关系各不同组间血脂生化指标的比较显示:2型糖尿病组以及血管病变各组与对照组比较,BMI、TC、TG、LDL-C均显著性高于正常对照组,而HDL-C显著性低于正常对照组;微血管病变组与非微血管病变组比较,BMI、TC、TG、LDL-C均显著性高于正常对照组,而HDL-C显著性低于正常对照组;大血管病变组与非大血管病变组比较,BMI、TC、TG、LDL-C均显著性高于正常对照组,而HDL-C显著性低于正常对照组;大血管病变组与微血管病变组比较,BMI、TC、LDL-C均显著性高于微血管病变组,而HDL-C显著性低于微血管病变组。TNF-α血清含量在2型糖尿病不同血管病变组间及对照组的差异显示:2型糖尿病患者组TNF-α血清水平为56.26±11.34pg/mL,对照组为28.97±8.89pg/mL,非微血管病变组为49.73±10.35 pg/mL,微血管病变组为59.56±12.41 pg/mL,非大血管病变组为48.53±11.25pg/mL,大血管病变组为61.76±9.47pg/mL。与正常对照组相比,2型糖尿病各组中患者血清TNF-α含量均显著升高(P<0.01);与非微血管病变组比较,微血管病变组血清TNF-α含量显著升高(P<0.01);与非大血管病变组比较,大血管病变组血清TNF-α水平显著升高(P<0.01);微血管病变组与大血管病变组比较未见显著性差异(P>0.05)。3 TNF-α-308G/A基因多态性分布与2型糖尿病发病的关系GA+AA基因型频率在T2DM组和Control组两组之间没有显著性差别(P>0.05);G、A等位基因频率在两组间没有显著性差异(P>0.05),也就是说,SNP-308多态性位点的基因型频率和基因频率在两组间没有显示出统计学意义(P>0.05)。结论:1 IL-10及TNF-α血清水平在糖尿病组与正常对照组间的差异支持2型糖尿病是一种“慢性低度炎症状态”的假说,说明它的发病可能与诸多炎症细胞因子相关。其中IL-10能抑制细胞因子的生成,具有多方面的抗炎效应,具有较强的免疫抑制作用,因此IL-10血清水平的降低,可能促进了这种“慢性低度炎症状态”的发展,从而失去了IL-10对2型糖尿病发病的保护作用。本研究通过唐山地区符合条件的病例的分析,认为IL-10-592多态性与2型糖尿病的易感性可能存在一定的相关性,IL-10基因多态性可能是2型糖尿病的易感因素之一,并且它对于2型糖尿病的预后康复也具有密切关系。2 TNF-α作为一种重要的炎性因子,鉴于其血清水平在糖尿病组与正常对照组间的差异,说明其参与了2型糖尿病的发病过程,TNF-α在2型糖尿病大血管病变组较无大血管病变组中显著升高以及微血管病变组较无微血管病变组中显著升高,说明TNF-α是2型糖尿病血管并发症的危险因素,可能通过胰岛素抵抗促进2型糖尿病及其血管病变的发生、发展。3但是对于其基因型TNF-α-308的研究,未发现显著性差异。参考文献,对于其基因多态性的研究结果意见不一,有人得到了阳性结果。本研究考虑,2型糖尿病毕竟是一种多基因相关的疾病,它的病因涉及种族遗传、环境区域等众多因素。本研究得出的结果仅是从炎性因子的一个角度出发,而且局限于唐山地区的人群。如果扩大人群范围,并且增加样本量,所得到的结果将更具有说服力。