背景对于严重烧创伤引起的大面积体表组织缺损或肢体缺失,相比于传统的自体组织转移疗法,异体复合组织移植（VCA）在组织来源、外形和功能重建效果等方面均具有明显优势。然而目前VCA受体在移植后需要终生服用免疫抑制药物,同时也无法避免急慢性排斥反应的发生。为解决上述问题,就需要诱导受体产生对供体的特异性免疫耐受。经静脉输注供体骨髓单个核细胞（i.v.BMT）可诱导受体产生供-受体嵌合体,使受体对移植物产生免疫耐受。但此方法需要对受体进行清髓预处理,由此带来的严重不良反应限制了其在临床VCA中的应用。而在某些VCA移植物中本来就包含各种骨髓干细胞和对应的骨髓微环境,相当于同时进行血管化骨髓移植（VBMT）。有动物实验证实,相对于i.v.BMT,VBMT能够更有效地诱导供-受体嵌合体和免疫耐受的形成,同时也避免了清髓预处理,因此后者可能更适用于临床VCA。但在进行VBMT后,其中的骨髓细胞会逐渐被受体来源细胞取代,最后仍然会导致VCA移植物被排斥。如果能将VBMT与i.v.BMT结合起来,或许能够取长补短,建立一个不清髓的长期免疫耐受诱导方案,从而促进临床VCA的广泛应用。目的首先,建立两个简便、可靠的小型猪VCA模型。其中一个的移植物含有血管化骨髓（VBM）成分,另一个则没有。其次,构建一种能够高效获取大量猪骨髓单个核细胞的方法。最后,在不清髓条件下分别对比VBMT、i.v.BMT和二者联合对VCA移植物生存的影响,同时探讨其可能机制。方法1.建立改良的小型猪VCA模型。以胫骨骨肌皮瓣为移植物来源,在巴马小型猪之间进行移植,建立一个简便、可靠的大动物VCA模型。共有两种VCA移植物,其中一种含有VBM成分（移植物1）,另一种不具有（移植物2）。在手术显微镜下将移植物血管与受体股动静脉进行吻合,并将移植物放置于受体背外侧腹壁上。术中观察并记录移植物的解剖学参数,统计手术各步骤需要的时间,术后对移植物进行大体和病理学观察,以验证此模型应用于后续实验的可行性。2.构建获取大量猪骨髓单个核细胞的方法。手术取出猪胸椎到腰椎之间的所有椎体,而后分别使用摆锯和碎骨机将其粉碎为骨粒,经过反复冲洗后获得全骨髓细胞悬液。分别使用羟乙基淀粉沉降法（对照组）和全封闭离心法（实验组）分离其中的骨髓单个核细胞,并对两种方法分离得到的骨髓单个核细胞进行下列对比:在倒置光学显微镜和扫描电子显微镜下观察细胞的形态;对分离到的细胞进行人工计数,计算出两种方法的细胞获取总量和平均细胞获得率;流式细胞术检测细胞活力和各型细胞所占比率。3.非清髓条件下VBMT、i.v.BMT及二者联合对于VCA移植物生存时间的影响与其机制研究。分别以雄性长白猪和雌性巴马小型猪为移植供受体,所有受体均接受包括糖皮质激素、胸腺照射和逐渐减量的他克莫司在内的非清髓性免疫治疗方案,并持续到术后90天为止。根据受体接受供体骨髓移植方法不同,将其分为4组:第1组（VCA组,n=4）仅接受不含VBM的VCA移植物;第2组（VCA+VBMT组,n=4）接受含有VBM的VCA移植物;第3组（VCA+i.v.BMT组,n=4）接受不含VBM的VCA移植物,在术后第7天时接受来自供体的i.v.BMT;第4组（VCA+VBMT+i.v.BMT组,n=6）接受含有VBM的VCA移植物,在术后第7天时接受来自供体的i.v.BMT。术后对各组受体及其移植物进行观察,记录其生存时间;定期对移植物进行病理学观察,评估其排斥反应程度;术后定期使用q PCR法测定受体外周血中的嵌合体比例,并在观察终点时使用同样方法对第2、4组VCA移植物中的嵌合体比例进行分析,记录其中的骨髓细胞数量,并对VBM成分进行病理观察。结果1.获取的胫骨骨肌皮瓣移植物的解剖学参数分别为:动脉,长度10.3±1.4 cm,直径2.9±0.4 mm;静脉,长度11.8±1.0 cm,直径3.2±0.4 mm;皮肤,面积65.3±18.0 cm²;肌肉,面积61.7±14.0 cm²;骨骼,长度5.1±0.5 cm。移植物1的平均取材时间为57.2±3.6 min,移植物2的平均取材时间为52.5±4.2 min,移植手术中移植物的平均缺血时间为65.3±3.0 min。无一例移植物因手术原因死亡,术后移植物1和移植物2的平均生存时间分别为7.8±1.3 d和7.5±0.9d,二者差异无统计学意义（P>0.05）。术后3d时移植物的皮肤组织HE染色结果显示其血供良好。移植物1的骨骺端中存在大量骨髓细胞,骨髓腔中则无;移植物2则只能观察到骨皮质,没有骨髓成分。2.每头供体平均可获得的椎体重量为415.3±21.2 g。细胞形态学观察结果显示分离到的细胞大多为单个核细胞,对照组获得的细胞形态较实验组良好。对照组中每头供体平均可获得的骨髓单个核细胞数量为（1.53±0.32）×10¹⁰个,从椎体中获得细胞的平均获得率为（3.82±0.44）×107/g;实验组的细胞获得量为（2.36±0.24）×10¹⁰个,细胞平均获得率为（5.73±0.56）×107/g,相应指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞结果显示对照组获得的活细胞比例为98.43±0.70%,实验组则为93.1±0.75%,差异具有统计学意义（P<0.05）,但实验组活细胞数量(（2.17±0.34）×10¹⁰)仍然高于对照组(（1.49±0.21）×10¹⁰,P<0.05);二者的各亚型细胞比例差异则不具有统计学意义（P>0.05）。3.联合使用糖皮质激素、胸腺照射和他克莫司可以在术后21天内有效地降低受体外周血中淋巴细胞数量,为VCA和供体骨髓单个核细胞植入提供必要条件。第1组和第3组的移植物平均生存时间分别为10.3±1.3 d和12±2.2 d;第2组的移植物平均生存时间为40±10.7 d,相比于第1、3组差异具有统计学意义（P<0.05）;第4组的移植物平均生存时间为110±10.2 d,相比于前3组差异具有统计学意义（P<0.05）。第1组受体外周血中始终未检测到嵌合体存在;第2组在术后第3天即检测到嵌合体存在（2.2±0.3%）,随后外周血嵌合体比例持续降低,到术后60天时已无法检测出;第3组在术后第7天行i.v.BMT后曾短暂检测出外周血嵌合体（1.2±0.1%）存在,随后即消失;第4组术后第3天即检测到外周嵌合体（2.2±0.3%）,进行i.v.BMT后升高至3.2±0.2%,在药物治疗期间外周嵌合体水平一直维持在3%左右。第4组在术后90天时,移植物中的骨髓细胞数量和供体来源细胞比例均远高于第2组和第4组移植物发生排斥反应时的相应参数,病理学观察也符合这一结果。结论1.本研究建立的两个小型猪VCA模型具有操作简便、可靠性强的优点,可以为VCA相关研究和VBMT的致耐受性研究提供大动物模型基础。2.相比较于传统的羟乙基淀粉沉降法,本研究建立的全封闭离心法可以在较高的效率下收集到更多有活性的骨髓单个核细胞,同时避免了分离试剂的潜在毒性和细胞污染的可能性,因而更适用于大量分离骨髓单个核细胞的需要。3.在非清髓性免疫治疗方案作用下,将VBMT和i.v.BMT联合应用可增加移植物VBM中的供体细胞数量和比例,稳定维持受体外周血中的嵌合体比例,从而显著延长VCA移植物的生存时间。