目前为止,以吗啡为代表的阿片类药物(opioid drug)依然是无法替代的治疗剧烈疼痛的有效药物,此类药物具有良好的镇痛活性,但是由于中枢神经系统的严重不良反应,尤其是呼吸抑制,耐受及成瘾等副作用,极大的限制了临床上的应用。为此,人们一直都在致力寻找镇痛作用好且成瘾性小的理想阿片类药物,并且在对于阿片类药物构效关系不断探索的过程中,人们对其作用的体内特异性物质基础——阿片受体(opioid receptor)也有了更为深入的认识。通过对吗啡的化学结构进行改造,出现了一系列的半合成和全合成的阿片类化合物,噻吩诺啡(thienorphine)就是其中之一。噻吩诺啡是我所自行设计合成的一个结构新颖的阿片受体部分激动剂,与临床常用的同类药丁丙诺啡比较,噻吩诺啡具有镇痛效能强、有效时间长、口服吸收好、对抗吗啡作用强大及安全性高等特点,目前已进入临床研究阶段,并且有望成为一个较理想的防复吸戒毒新药。然而噻吩诺啡对于μ、κ受体只具有部分激动作用,其镇痛作用还是不够理想,因此为了提高噻吩诺啡的镇痛作用,在其构效关系研究的基础上,新合成出一个保留有桥环和噻吩环结构特点的噻吩诺啡衍生物030418(N-methyl-7α-[(R)-1- hydroxy-1-methyl-3-(thien-3-yl)-propyl]-6,14-endo-ethanotetrahydronororipavine)。通过初步的动物实验发现,该化合物同时具有镇痛作用强(最大有效镇痛剂量为6μg/kg,s.c.),有效时间较长(镇痛t1/2为8 h),躯体和精神依赖潜能低(在目前大部分依赖模型上没有发现明显的依赖反应)等引人注目的特点,这与其它阿片类药物(如:吗啡、芬太尼、丁丙诺啡和噻吩诺啡等)的性质都不相同。已有的大量研究结果表明,阿片类药物的镇痛和依赖均由阿片受体介导,但是由于药物对阿片受体的选择性和激动强度不同,其药理作用特点会差异很大。目前,有关030418的药理作用特点与对阿片受体的选择性和激动特性的关系,以及030418介导的受体间的相互作用机制尚不清楚。因此,本课题研究如下:研究目的:系统地探讨030418与阿片受体之间的作用特点,并在此基础上对其镇痛、依赖相关的药理机制以及阿片受体间的相互关系进行初步的研究,从而进一步分析该类长效化合物的构效关系(structure-activity relationship)与阿片受体之间的作用特点,为研发理想的高效、低成瘾镇痛药物提供一定的理论和实验依据。研究方法:首先,在稳定转染μ、κ、δ和ORL1受体的CHO细胞上进行放射性配体结合和[35S]GTPγS实验,研究030418对不同阿片受体亚型的亲和力以及激动活性。其次,在小鼠热辐射甩尾和热板模型上确定030418的镇痛和耐受作用,在小鼠戒断跳跃模型上评价030418的躯体依赖性;在整体动物模型上应用选择性拮抗剂预先阻断相应受体,观察各阿片受体亚型功能对030418镇痛、耐受和躯体依赖性的影响;在离体豚鼠回肠上研究030418与阿片受体结合后的解离速度;在CHO-μ细胞上采用时间分辨荧光共振能量转移免疫法对胞内3’,5’-环磷酸腺苷(cAMP)进行测定,研究030418慢性处理后对于μ受体的脱敏以及纳洛酮引起的cAMP超射情况。最后,在原代培养的大鼠神经元细胞和用带有HA,Myc或Flag标签的KOR和ORL1受体质粒共同转染的CHO、HEK293细胞上,采用免疫荧光和免疫共沉淀的方法,研究阿片KOR和ORL1受体之间的共定位和相互作用;通过质粒重组和脂质体介导转染,筛选并建立了稳定共转染的CHO-KOR/ORL1细胞株。研究结果:1.在稳转各受体亚型的CHO细胞上,配体竞争实验结果显示,030418与μ、κ、δ和ORL1受体均有较强的亲和力,Ki值分别为0.91 nM、0.60 nM、0.58 nM和1.6 nM。[35S]GTPγS实验结果显示,030418对μ、κ、δ和ORL1受体均有激动活性,以相应的选择性激动剂DAMGO、(±)U50,488H、SNC80、N/OFQ作为参照,其Emax值分别为89%、86%、67%和91%,EC50值分别为0.10 nM、0.15 nM、0.38 nM和15.0 nM。结果提示,030418对阿片受体亚型的亲和力成非选择性,对阿片受体的激动强度依次为μ≈κ≈ORL1 >δ。2.在小鼠甩尾和热板实验上,030418(s.c.)镇痛的ED50值分别为2.34μg/kg、2.59μg/kg,其镇痛作用明显强于吗啡,与二氢埃托啡相当,其镇痛作用维持时间远比后两者长。与吗啡相比,高剂量重复给药能够导致030418产生较为快速的镇痛耐受,但是反复递增剂量给予030418后用纳洛酮催促戒断,小鼠的戒断跳跃反应不明显。整体动物结果进一步证实,030418镇痛作用强,有效时间长,无明显躯体依赖潜能。3.在热板镇痛模型上,预先给予非选择性阿片受体拮抗剂naloxone(1.0 mg/kg,s.c.)能够完全阻断030418的镇痛作用,预先给予选择性μ拮抗剂naloxonazine(25μg/mouse,i.c.v.)、β-FNA(10μg/mouse,i.c.v.)或选择性κ拮抗剂nor-BNI(3.7μg/mouse,i.c.v.)则可以部分地降低030418的镇痛作用,而选择性ORL1拮抗剂J-113397(4.0μg/mouse,i.c.v.)则能够部分地增强030418的镇痛作用。在镇痛耐受模型上,应用选择性ORL1拮抗剂J-113397可以部分减轻吗啡和二氢埃托啡的镇痛耐受,但是却不能减缓030418镇痛耐受的发展。在躯体依赖模型上,伴随给予选择性拮抗剂nor-BNI或J-113397都不能翻转030418极低的躯体依赖症状。结果提示,030418的镇痛作用是由阿片μ受体和κ受体共同介导的,ORL1受体对于030418的镇痛具有部分抑制作用,而030418的快镇痛耐受和低依赖潜能可能与激动κ受体和ORL1受体有关,但不是主要原因。4.在离体豚鼠回肠实验中,030418(0.1 mM)对1μM氯化乙酰胆碱引发的回肠纵肌收缩具有显著的抑制作用。用灌流液反复冲洗,030418组消除此抑制作用所需时间明显长于等效剂量的吗啡(5 mM)组和二氢埃托啡(0.2 mM)组。结果提示,030418与阿片受体结合牢固,不易解离。5.在慢性药物处理CHO-μ细胞的脱敏实验中,与对照组相比(抑制率为83%),DAMGO(10μM)或030418(10μM)处理细胞24 h后,能显著的降低DAMGO对于forskolin引发的cAMP升高的抑制作用,分别降至31%和8%。在慢性药物处理CHO-μ细胞的cAMP超射实验中,DAMGO(10μM)或吗啡(10μM)处理细胞24 h后,用naloxone催促能够引起胞内cAMP水平明显升高,超射百分率分别达到339%和291%,但是03041(810μM)慢性处理组细胞却未能出现明显的cAMP超射现象。结果提示,030418对μ受体下游cAMP信号系统的影响与DAMGO和吗啡不同。6.在原代培养的新生乳鼠海马和皮层神经元上,通过免疫荧光可见KOR和ORL1受体在细胞膜上分布并且存在重叠现象,同样在HA-KOR和Myc-ORL1共同瞬转的CHO和HEK293细胞上受体的分布也有类似的发现。在共同表达Flag-KOR和Myc-ORL1蛋白的CHO细胞裂解液中,阿片KOR与ORL1受体能够被相互免疫共沉淀。结果提示,KOR与ORL1受体间可能存在相互作用。7.利用重组质粒pcDNA3.1/HygroB(+)转染CHO-ORL1细胞株,共转染KOR和ORL1受体的CHO细胞在含有G418和HygroB的双重选择性培养基中生长出35个耐药单克隆,通过RT-PCR和配体结合实验,筛选出了稳定高表达的CHO-KOR/ORL1细胞株。在此共转CHO-KOR/ORL1和单转CHO-KOR细胞上的[3H]-diprenorphine竞争结合实验结果表明,其选择性配体(±)U50,488、N/OFQ和030418与受体的亲和力没有发生改变。这些结果也为进一步研究KOR与ORL1受体间的相互作用提供了实验基础。结论:030418是一个新型的阿片受体激动剂。体内、体外实验结果均显示,030418对于阿片受体各亚型的亲和力都很高且不具有选择性,对于μ、κ和ORL1受体都具有完全的激动作用,而且与阿片受体结合后的解离速度非常缓慢,而这些特点与030418 N位上的甲基和C7位上的噻吩环结构有密切关系。进一步的研究结果提示,030418的强镇痛作用与激动μ受体和κ受体有关,有效时间长与受体结合牢固和不易解离有关,镇痛耐受的快速形成可能与030418长期刺激μ受体产生明显的cAMP信号通路的脱敏有关,躯体依赖潜能较小与030418在细胞上不能够有效的引起μ受体介导的cAMP超射有一定的联系。此外,本课题还证实了具有相似“抗μ受体功能”的KOR和ORL1受体在细胞水平分布上存在共定位现象,并且可能存在异源二聚化。但是对于阿片KOR和ORL1受体的相互作用以及与030418低依赖潜能的关系还有待于进一步研究。