研究背景和目的食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,全世界每年约有20万人死于食管癌,对人类的生命和健康造成极大威胁。食管癌的病因尚未完全明了,通过多途径探索,发现其发病与遗传因素、亚硝胺慢性刺激、炎症及创伤、粮食和蔬菜中的微量元素含量等相关,但其确切致病机制有待深入研究。EC9706细胞是来源于食管癌组织的细胞株,在体外以EC9706细胞为研究对象,对于探讨和认识食管癌的生物学行为有重要的价值。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(serine protease inhibitor kazal type,SPINK),成员包括SPINK1~12等多个亚族,该家族成员多与疾病和肿瘤相关,如spink1与胰腺癌相关,spink2与男性不育相关,spink7为食管癌相关基因等。spink7已被证实为肿瘤抑制基因,具有调控细胞增殖、诱导凋亡及抑制肿瘤迁移和侵袭等功能。以往的研究发现,食管组织内有SPINK8蛋白的内源性表达,同时另一项全基因组比对结果显示,spink8基因相对表达量在成人食管癌组织比正常食管及癌旁组织明显减少。但有关SPINK8蛋白的功能研究国内外文献报道甚少。spink8与spink7具有同源性,且模拟三维结构相似,但两种蛋白的氨基酸序列有部分差异,推测这两种蛋白特异性抑制的蛋白酶可能有所不同。本研究将根据NCBI数据库记录的spink8 c DNA序列构建能够表达sh RNA的重组质粒,并应用脂质体介导,将干扰重组质粒和过表达质粒分别转染EC9706细胞,观察EC9706细胞中spink8基因的表达情况,并讨论沉默spink8内源性基因及过表达SPINK8蛋白对EC9706细胞增殖、迁移和克隆形成能力的影响。实验将探索spink8是否属于抑癌基因,并初步阐述其作用方式,为食管癌的发生发展提供可能得新的理论机制,以求为治疗提供新的作用靶点。材料和方法1.以spink8的m RNA已知序列为靶点,构建p Genesil-SPINK8重组质粒及阴性对照质粒。2.重组干扰质粒p Genesil-SPINK8、阴性对照质粒、重组过表达载体p EGFP-C1-SPINK8和空质粒p EGFP-C1分别转染EC9706细胞株,细胞分为5组,即未处理组、干扰组、阴性对照组、空载体组和过表达组,分别用半定量RT-PCR和Western Blotting检测对蛋白表达水平进行鉴定。3.绘制MTT生长曲线检测转染后各实验组细胞的增殖能力。4.克隆形成实验检测转染后各实验组的细胞克隆形成能力。5.划痕愈合实验检测转染后各实验组细胞的体外迁移能力。6.统计学分析:所有数据均由SPSS17.0软件处理,定量资料应用均数±标准差(Mean±SD)表示;多组均数差异的比较采用单因素方差分析(ANOVA),并用LSD-t法进行组间比较;以α=0.05为显著性检验水准。结果1.成功构建p Genesil-SPINK8重组质粒,并且应用限制性内切酶SalⅠ进行消化,证实重组质粒能被切出长约400 bp的小带;测序结果与设计的完全相符。2.p Genesil-SPINK8重组质粒转染EC9706细胞后,RT-PCR检测和Western Blotting结果显示,spink8在m RNA和蛋白的表达水平均受到明显抑制(P<0.05)。3.p EGFP-C1-SPINK8重组质粒转染EC9706细胞后,RT-PCR检测和Western Blotting结果显示,spink 8在m RNA和蛋白的表达水平均明显提高(P<0.05)。4.MTT生长曲线结果显示,过表达SIPNK8蛋白能够抑制EC9706细胞增殖,而干扰其表达后细胞的增殖能力增强。5.克隆形成实验结果显示,过表达SPINK8蛋白的EC9706细胞体外克隆形成能力下降,而干扰其表达后克隆形成能力提高。6.划痕实验结果显示,过表达SPINK8蛋白的EC9706细胞体外迁移能力降低,而干扰其表达量后的细胞迁移速率加快。结论1.成功构建p Genesil-SPINK8重组质粒。2.合成的si RNA能够有效抑制EC9706细胞SPINK8蛋白的内源性表达。3.spink8基因对EC9706细胞的增殖及克隆形成能力具有一定的抑制作用。4.spink8基因对EC9706细胞体外迁移能力具有一定的抑制作用。