【摘 要】
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胆绿素还原酶(BVR)存在于哺乳动物及某些鱼类的细胞液中,并在血红素降解过程中将胆绿素还原成胆红素,BVR是生物体内存在的唯一的一种在不同pH条件下利用不同供氢体的还原酶,B
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胆绿素还原酶(BVR)存在于哺乳动物及某些鱼类的细胞液中,并在血红素降解过程中将胆绿素还原成胆红素,BVR是生物体内存在的唯一的一种在不同pH条件下利用不同供氢体的还原酶,BVR还具有核定位功能.目的 将重组的大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中表达、纯化并测定活性.方法 将构建的大鼠肾胆绿素还原酶的重组质粒转化到大肠杆菌`BL-21中,研究培养温度、摇床转速对BVR蛋白表达的影响,确定可溶性表达的最佳条件.BVR纯化过程为裂解菌体、分离上清、盐析、层析.采用SDS-PAGE进行分子量鉴定;Lowry法进行蛋白含量测定;SDS-PAGE、薄层扫描、Glyko BandScan Version软件进行纯度鉴定.采用光谱扫描法检测BVR酶活性和Km值.结果与结论 研究结果显示,BVR可溶性表达最佳温度为37℃,摇床振荡速度为120±5rpm;BVR纯化路线:离心收集菌→4℃溶菌酶裂解(搅拌)60min→20s超声/10s间歇,功率800kw/h,超声8个循环→4℃150,000g超速离心60min→4℃35％~65％硫酸铵分级盐析→4℃65.0cm x3.5cm G-100分子筛柱层析;纯化后电泳显示为单一条带,薄层扫描纯度为92.2％,软件分析纯度为94.1％;活性测定具有BVR催化活性,NADH(pH6.7)和NADPH(pH8.5)对应的BVP的Km值分别是380μmol/L、3.5μmol/L;纯化倍数为4.3倍,回收率为19.8％.该实验表达纯化的BVR酶蛋白可作为工具酶用于血红素加氧酶等相关酶的活性研究;所确定的BVR表达纯化方法为进一步研究BVR的性质及功能奠定了基础.
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