肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,易转移复发,严重危害我国人民的健康。肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗,化疗是综合治疗的重要手段之一,尤其对不能手术的中晚期患者,也是主要的辅助疗法。但肝癌对化疗不敏感,致使化疗疗效仍不理想。因此,探索新的肿瘤治疗靶点和有效的化疗药物对提高化疗疗效具有重要意义,而新的治疗药物的寻找很显然依赖于肝癌发生发展机制的阐明。近年的研究表明端粒酶的激活和异常的基因甲基化参与肝癌的发生发展,靶向端粒酶和基因甲基化的药物有望成为新的治疗药物。端粒酶是一种核糖蛋白复合物,负责合成端粒重复序列(TTAGGG)并添加到染色体末端,补偿了随细胞分裂而出现的端粒丢失,稳定了永生化细胞的端粒长度。它由人端粒酶逆转录酶(hTERT)、人端粒酶RNA组分(hTR)以及人端粒酶相关蛋白(hTEP1等)组成。端粒酶的活化是细胞永生化和肿瘤形成的重要一步,而其hTERT组分的表达是决定端粒酶活性的限速步骤。在本实验室前期肝癌端粒酶相关研究中,发现HCC的端粒酶阳性率为85%,明显高于癌旁组织、肝硬化组织及慢性肝炎组织,而正常肝脏组织不表达端粒酶活性,认为端粒酶的表达可能在HCC的发生发展中起到了关键的作用。DNA甲基化(methylation)是一种表观遗传修饰形式,也是基因表达调控的重要机制之一。它是指利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基,在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)催化下,将CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5’位置的氢用活性甲基所取代,从而转变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。发生在基因启动子或其附近区域的甲基化将通过直接的或结合特定甲基化CpG序列结合蛋白(methyl CpG binding protein,MBP)的间接方式阻碍转录因子与启动子的结合而阻止或降低基因的转录。正常的甲基化对于维持机体的功能是必需的,而异常的DNA甲基化则会引发疾病甚至肿瘤的发生。人类各种肿瘤都存在不同程度的抑癌基因的甲基化,我们的前期研究发现肝癌组织中,p21,p15,p16,E2F-1和Wilm’s tumor 1 tumor suppressor (WT1)等基因的甲基化水平明显高于癌旁及肝硬化组织,认为DNA甲基化亦在肝癌的发生发展中起重要作用。5-杂氮脱氧胞苷(decitabine,DAC)是一种具有多种生物学性质的核苷类似物,它最初合成作为一种抗代谢药物用于诱导急性髓性白血病。现普遍认为5-杂氮脱氧胞苷是一种DNA甲基转移酶抑制剂,通过去甲基化作用而激活肿瘤细胞中的一些抑癌基因,可能是其抗肿瘤机制之一。最近的研究表明5-杂氮脱氧胞苷能下调某些肿瘤细胞中端粒酶的活性和hTERT的表达,但其机制不明确。作为端粒酶活性调控的关键,hTERT表达的调控是多水平,多层次的,包括转录水平的调控及转录后的修饰等。基因序列分析显示hTERT的启动子区域不含有TATA和CAAT盒,但是富含GC二核苷酸,在转录起始位点附近形成一个大的CpG岛,这提示甲基化可能参与hTERT的表达调控；同时其启动子区包含很多不同转录因子结合位点,提示hTERT的表达受多水平的的调控,在不同的细胞背景中,可能受不同转录因子的调控。目前已发现多种正向和负向调控转录因子,其正向调控因子包括：c-myc,Sp1,人乳头瘤状病毒16 E6,类固醇激素；负向调控因子包括：Mad1,p53, pRB, E2F, WT1等。本实验室前期的研究也发现肝癌组织中端粒酶活性的上调与相关基因的甲基化相关。鉴于以上,5-杂氮脱氧胞苷作为一种去甲基化的药物,可能通过直接改变hTERT启动子区域的甲基化或间接改变其调控基因的表达而影响端粒酶的活性。我们在肝癌细胞系中进行了以下三个方面的研究：1) 5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞系中端粒酶活性的影响；2) 5-杂氮脱氧胞苷对端粒酶活性影响的机制研究；3) 5-杂氮脱氧胞苷和化疗药物顺铂联合处理对肝癌细胞生长和凋亡的影响。第一部分去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞端粒酶活性的影响首先应用不同剂量的5-杂氮脱氧胞苷处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,观察5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞存活的影响以及其细胞毒性和剂量、时间之间的关系；其次,根据以上实验结果选用合适的药物作用浓度(1μM,2μM和4μM)和作用时间(1d,3d和5d),处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,分别用TRAP-ELISA、real time RT-PCR及’Western blot法检测在不同的药物作用浓度和作用时间下,肝癌细胞中端粒酶的活性和hTERT的表达变化。结果显示,两种肝癌细胞系中都有端粒酶的激活；5-杂氮脱氧胞苷能够下调肝癌细胞中端粒酶的活性和hTERT的表达,而且这种下调作用是具有剂量和时间依赖性的,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,端粒酶的活性和hTERT的表达抑制作用增强。第二部分去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷下调肝癌细胞端粒酶活性的机制研究由于hTERT的表达受多种转录因子和表观遗传甲基化修饰的调控,而5-杂氮脱氧胞苷是一种去甲基化的药物,本部分实验拟从端粒酶的调控因素和基因甲基化的角度出发,探讨5-杂氮脱氧胞苷下调肝癌细胞端粒酶活性的分子机制。目前的研究表明5-杂氮脱氧胞苷能通过去甲基化的机制激活某些基因的表达,又在肿瘤组织和细胞系中发现hTERT启动子区存在甲基化,并且甲基化程度与hTERT的表达成正比。所以5-杂氮脱氧胞苷可能通过直接影响hTERT启动子区的甲基化状态而影响hTERT的表达。鉴于HepG2是目前最为通用的肝癌细胞系,我们选择HepG2进行研究。我们用甲基化特异性PCR (MSP)法检测了hTERT启动子区的甲基化状态,并比较了不同作用浓度和作用时间的5-杂氮脱氧胞苷对hTERT启动子区的甲基化的影响。结果显示,在HepG2中hTERT启动子区并未检测到甲基化,5-杂氮脱氧胞苷对其甲基化状态并无影响。提示hTERT启动子区的甲基化状态可能不是hTERT表达的主要调控机制,而5-杂氮脱氧胞苷下调hTERT的表达可能不是通过直接影响其启动子区甲基化的水平。其次,据研究hTERT的表达调控主要是在转录水平,其启动子区包含很多不同转录因子的结合位点,这些转录因子包括正向调控的因子：c-myc,Spl,人乳头瘤状病毒16 E6,类固醇激素；和负向调控因子：Mad1, p53, p15, p16, p21, pRB, E2F和WT1。我们推测5-杂氮脱氧胞苷可能通过影响其调控因子的表达而间接下调hTERT的表达。结合我们前期在肝癌组织中发现的与端粒酶升高相关的甲基化基因,我们选择了以下基因进行研究：c-myc, p15, p16, p21, E2F和WT1。应用real time RT-PCR法分别检测有无5-杂氮脱氧胞苷作用时肝癌细胞系HepG2中c-myc, p15, p16, p21, E2F,和WT1的mRNA水平；观察比较5-杂氮脱氧胞苷对这些基因表达的影响。结果显示：c-myc, p15, p16,p21,E2F,和WT1在肝癌细胞系HepG2中有不同程度的表达,p16基因则低表达。5-杂氮脱氧胞苷使p16表达上调,同时下调了c-myc的表达。由于p16是hTERT的负向调控因子,而且5-杂氮脱氧胞苷主要的生物学功能是去甲基化作用,进一步研究p16基因的甲基化状态。结果发现肝癌细胞中p16基因存在甲基化,而5-杂氮脱氧胞苷逆转了其甲基化状态而上调了其表达。同时p16又是c-myc的负向调控因子,5-杂氮脱氧胞苷对c-myc的下调作用可能与p16上调有关。这些结果提示,肝癌细胞中hTERT的表达与c-myc, p16的调控相关,5-杂氮脱氧胞苷可能通过下调c-myc和激活p16的表达而下调hTERT的表达。第三部分5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞化疗敏感性的影响首先应用不同剂量的顺铂处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,观察顺铂对肝癌细胞存活的影响以及其细胞毒性和剂量、时间之间的关系；其次,根据以上实验结果选用合适的药物作用浓度和作用时间,5-杂氮脱氧胞苷和顺铂联合和单独处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,观察比较两种情况下肝癌细胞生长情况的影响；并进一步通过DAPI染色、PI-AnnexinV染色流式细胞术检测观察5-杂氮脱氧胞对肝癌细胞凋亡的影响。结果显示联用5-杂氮脱氧胞苷和顺铂比单独使用顺铂对肝癌细胞生长的抑制作用更强,诱导肝癌细胞的凋亡率升高。提示5-杂氮脱氧胞苷增加了肝癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性。结合前部分的研究,其机制可能是5-杂氮脱氧胞苷下调端粒酶的表达。综上所述,我们的研究结果提示如下结论：1、去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷可以下调肝癌细胞系中端粒酶的活性和hTERT的表达。2、5-杂氮脱氧胞苷下调hTERT的表达主要通过去甲基化激活其负向调控因子p16的表达和下调c-myc的表达,而不是通过直接改变hTERT本身启动子区的甲基化状态。3、5-杂氮脱氧胞苷增加了肝癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性,有望与化疗药物联合应用于临床。