目的：通过对先证者进行二代高通量基因测序，并对候选变异位点在家系样本DNA中进行Sanger测序验证。根据筛查出的HARS2基因突变位点，构建过表达野生型和突变型HARS2基因的稳定转染HEK293T细胞系，验证突变对HARS2蛋白的功能影响，为研究HARS2基因突变致Perrault综合征的致病机制奠定基础。
　　方法：首先根据先证者二代高通量基因测序结果对家系成员三代共10人的DNA进行HARS2基因测序并验证，通过生物信息学分析预测突变对HARS2蛋白的功能影响。构建表达Asp117Asn突变、Leu303Pro突变和野生型HARS2基因的慢病毒重组质粒，使用慢病毒包装系统将重组质粒转染至HEK293T细胞中，获得稳定转染Asp117Asn突变型HARS2基因的HEK293T细胞系(Asp117Asn细胞组)、稳定转染Leu303Pro突变型HARS2基因的HEK293T细胞系(Leu303Pro细胞组）、稳定转染野生型HARS2基因的HEK293T细胞系（WT细胞组），同时建立稳定转染空载体的HEK293T细胞系（NC细胞组）。采用蛋白印迹法（Western blot）检测以上各组中HARS2蛋白的表达；免疫荧光技术观察WT细胞组、Asp117Asn细胞组和Leu303Pro细胞组之间HARS2蛋白在细胞中定位的差异；Northern blot检测NC细胞组、WT细胞组、Asp117Asn和Leu303Pro细胞组中线粒体tRNAHis的氨酰化水平，比较各组间的差异。
　　结果：（1）对Perrault综合征家系中先证者及家系成员的基因测序显示：该家系中先证者及其哥哥为患者，携带HARS2c.349G＞A（p.Asp117Asn）和HARS2c.908T＞C（p.Leu303Pro）复杂杂合突变；先证者母亲、外婆、舅舅携带HARS2c.349G＞A（p.Leu303Pro）杂合突变；先证者父亲携带HARS2c.908T＞C（p.Asp117Asn）杂合突变。（2）HARS2p.Asp117Asn和HARS2p.Leu303Pro位于HARS2蛋白催化区域，在不同物种间高度保守，突变可能影响HARS2蛋白的催化功能。(3)Western blot结果显示：NC细胞组中HARS2蛋白无表达，WT细胞组、Asp117Asn细胞组和Leu303Pro细胞组中均见HARS2蛋白表达；Leu303Pro细胞组中HARS2蛋白表达量明显低于WT细胞组，差异有统计学意义（P＜0.001）；Asp117Asn细胞组中HARS2蛋白表达量与WT细胞组无明显差异（P＞0.05）。（4）免疫荧光结果显示：Asp117Asn细胞组、Leu303Pro细胞组、WT细胞组中HARS2蛋白均定位于线粒体中。（5）Northern blot结果显示：WT细胞组线粒体tRNAHis氨酰化水平较NC细胞组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与WT细胞组相比，Asp117Asn细胞组和Leu303Pro细胞组线粒体tRNAHis氨酰化水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.001）；Leu303Pro细胞组线粒体tRNAHis氨酰化水平较Asp117Asn细胞组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：（1）本研究在Perrault综合征家系中鉴出HARS2c.349G＞A和c.908T＞C两个致病突变位点，丰富了HARS2基因突变谱；通过生物信息学分析，HARS2c.349G＞A和c.908T＞C位于HARS2蛋白催化区域，突变可能影响HARS2蛋白的催化功能。（2）成功构建了过表达野生型和突变型HARS2基因的稳定转染HEK293T细胞株，为后续研究突变对HARS2蛋白功能的影响奠定了基础。（3）HARS2c.908T＞C突变导致HARS2蛋白的表达下降；HARS2c.349G＞A和c.908T＞C突变导致线粒体tRNAHis氨酰化水平下降，说明突变影响HARS2蛋白的氨酰化能力。