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背景与目的：病窦综合征和完全性房室传导阻滞等心律失常威胁生命，常需要植入人工电子起搏器治疗。尽管起搏器治疗有效，但人工心脏起搏器并非最佳选择，仍存在一些问题：缺乏对自身组织的生物反应性、电池寿命有限、永久性电极的植入、电极位置不稳及电磁干扰等，使其应用受限。因此，探讨对病窦综合征和完全性房室等缓慢心律失常患者重建具有正常生理功能的“生物心脏起搏器”，以取代电子心脏起搏器治疗，是当前心脏电生理领域研究的热点。近年来，虽有将骨髓来源间充质干细胞直接或基因修饰后移植至生物体内以构建心脏起搏点的研究报导，但其结果尚不能令人满意。研究表明，起搏离子流(funny current,If)是窦房结细胞舒张期自动除极化的主要决定因素，并在心率控制及神经递质对心率调节中起重要作用，而If形成的分子基础是超极化激活的环化核苷酸门控通道(Hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-gatedcation,HCN)基因家族。HCN基因家族包括四个成员，即HCN1～HCN4，其中HCN4在各种动物窦房结细胞中的比例均最高，是If产生及基本心率维持的重要因素。因此为探讨mHCN4基因修饰的犬骨髓间充质干细胞（canine marrow mesenchymal stemlcells,cMSCs）作为构建心脏生物起搏点的可行性，本研究在国家自然科学基金(30871060)的资助下，利用本课题组构建的mHCN4基因慢病毒载体，对基因转染后cMSCs进行心室肌外膜下移植，以期获得具有生物起搏的心脏起搏样细胞，为构建心脏生物起搏点提供“种子细胞”。研究方法1．采用细胞培养初期频繁换液和减少胰酶消化时间的方法分离培养cMSCs，倒置显微镜观察细胞形态学改变。2．MTT法检测细胞增殖活性及体外培养诱导分化检测。3．用流式细胞仪和细胞免疫荧光检测细胞表面抗原表达。4．对转染GFP基因的cMSCs观察形态学及转基因持续表达。5．mHCN4慢病毒载体(pLenti6.3-HCN4-IRES2-EGFP)及对照载体(pLenti6.3-IRES2-EGFP)分别转染cMSCs，依据绿色荧光蛋白(GFP)表达行流式细胞筛选，细胞免疫荧光和werstern blotting检测mHCN4蛋白表达。倒置显微镜观察细胞形态学改变。6．全细胞膜片钳检测mHCN4基因转染cMSCs及对照组的离子流通道动力学特征。7．基因转染cMSC犬心外膜下移植，恢复2周，定期检测体表心电图。2周后在颈部迷走神经刺激诱导缓慢心律失常状况下，多导电生理仪记录体表心电图。心外膜下心室注射部位起搏并记录体表心电图。8．基因转染cMSC犬心脏心外膜下移植后2周，HE染色观察移植细胞在心肌组织间存活，组织免疫荧光技术检测移植细胞中GFP和mHCN4蛋白表达，免疫组织化学法检测CD3和IgG及caspase3抗原表达。结果1．采用细胞培养初期频繁换液和减少胰酶消化时间的分离培养法，在第3代就可得到纯化的成纤维细胞样细胞，该细胞具有良好的增殖活性及诱导分化潜能。2．该细胞表面高表达CD29和CD44抗原，不表达CD34和CD45抗原。且细胞易于慢病毒基因转染，且有转基因持续表达能力。3．mHCN4慢病毒载体可成功转染cMSCs，经流式细胞仪筛选，获得稳定表达mHCN4蛋白的骨髓间充质干细胞。4．对稳定表达mHCN4基因的cMSCs行全细胞膜片钳检测，记录到超极化激活的内向电流，其半数最大激活电压为-91.5±9.2mV，斜率为19.4±3.8mV。反转电位是-29.7±2.5mV。该电流对细胞外Cs+高度敏感，且具有明显的时间及电压依赖特性，在-140mV电压下的电流密度为26.4±1.8pA/pF。在相同记录条件下，仅转染EGFP的cMSCs及未转染的cMSCs均未记录到超极化内向电流。5．基因转染MSCs犬心外膜下移植后，心电图记录显示实验组及对照组心率未见明显差异，均未记录到室性心律失常。2周后，在双侧迷走神经刺激下，对照组均出现自发的房室结结性心律，平均心率为21±5次/分，实验组6只出现室性心律，平均心率为45±9次/分，与对照组心率相比，心率显著增快，且其心电图QRS波形与心室起搏心电图基本一致。停止迷走神经刺激后，两组动物均恢复窦性心律。6．mHCN4基因转染MSCs后犬心外膜下移植，MSCs不仅在心肌内存活，而且还表达mHCN4和GFP蛋白，转GFP组MSCs也在体内存活，但不表达mHCN4蛋白。移植部位未见表达CD3和caspase3及IgG抗原表达。结论1．采用细胞培养初期频繁换液和减少胰酶消化时间的分离培养法，早期就可获得纯化的MSCs，具有良好增殖活性及转基因表达能力。2．慢病毒载体基因转染cMSCs后，经流式细胞仪筛选，MSCs持续稳定表达mHCN4蛋白及功能性mHCN4通道，产生起搏离子流If，有心脏起搏细胞的电生理学特性。仅转GFP基因及未转染的cMSCs不表达mHCN4蛋白和起搏离子流If。3．mHCN4基因转染MSCs后犬心外膜下移植2周后，在双侧迷走神经刺激下，对照组6只犬均出现房室结结性心律；实验组6只犬出现室性心律，且心率较对照组显著增快，心室起搏显示室性心律来源于细胞移植部位。4．基因转染MSCs后犬心外膜下移植，MSCs不仅在心肌内存活，还表达mHCN4蛋白，转GFP组及未转染的cMSCs也在体内存活，但不表达mHCN4蛋白。5．基因转染MSCs后犬心外膜下移植2周，未见免疫排斥及细胞凋亡反应发生。