1、研究背景和目的脑血管疾病(Cerebral vascular diseases,CVD)已成为我国城市和农村人口的第一位致残和死亡原因。随着人口老龄化和经济水平的快速增长及生活方式的改变,缺血性脑卒中发病率明显上升。目前我国现存CVD患者700余万人,其中有70%为缺血性脑卒中,且发病有逐年增多的趋势,致死率及致残率高。除了发病急性期6小时内的溶栓治疗,尚无更为有效地治疗措施。运用传统的治疗方法(溶栓、抗凝、护脑等),疗效欠佳。近年来国内外学者在干细胞治疗缺血性脑卒中的基础和临床研究方面取得的研究成果为缺血性脑卒中患者带来了希望。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能和强大的增殖能力,由于易从骨髓中分离及体外扩增纯化、自体移植能在体内跨系分化为神经细胞及避免伦理问题、来源广泛、易采集培养、低免疫排斥及能转染和长期表达外源性基因等优点,使其成为干细胞疗法治疗神经系统疾病的最佳种子细胞之一。因此,予以输注外来种子细胞以增加神经干细胞,继而增加“血管神经单位”(神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞)的数量用以修复神经功能缺损便成为热点话题。国内外学者在BMSCs移植方面做了大量的实验及临床研究,在取得了很多共识的同时又有很多亟待解决的问题。例如:BMSCs移植能否对缺血性脑卒中患者发挥有效的治疗作用?具体机制是怎样的?有效性方面如何评估?安全性如何?本课题的目的是初步探讨自体BMSCs经体外培养扩增富集后,静脉移植治疗缺血性脑卒中的临床疗效及安全性,为临床大力开展BMSCs治疗缺血性脑卒中提供临床依据。2、研究内容和方法本课题研究共分为二部分。第一部分:介绍自体BMSCs实验室培养及扩增传代方法步骤,通过Ficoll分离法分离骨髓单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),体外培养扩增出BMSCs,并通过形态学特征及流式细胞术检测其表面标志加以鉴定;第二部分:观察临床安全性,比较移植前、移植后随访3个月及6个月的临床症状,采用NIHSS评分(National Institutes of Health Stroke Scale,美国国立卫生院卒中量表)、BI指数(Barthel Index,巴氏量表)及FCA量表(Functional comprehensive assessment,功能综合评定量表)评价患者神经功能及认知改变,比较影像学资料和伴随疾病的改善情况。3、研究结果1)、骨髓单个核细胞在培养瓶中培养3～5天时,增殖较慢,成纤维样贴壁细胞逐渐出现;8～10天成纤维样贴壁细胞增殖较快,细胞形态均一,可达到80%融合;14天左右(传代为第2代时),细胞生长出现典型的漩涡状排列,细胞融合度可达90%。流式细胞仪检测BMSCs表面抗原高表达CD29、CD105及CD166,而低表达CD34、CD4及HLA-DR等。体外培养传代到第二代时进行流式细胞标志物鉴定为BMSCs。2)、对5位缺血性脑卒中患者进行BMSCs静脉移植,均无寒战发热、皮疹、消化道不适、癫痫等不良反应,随访3个月及半年内无癫痫及肿瘤出现。移植前后临床表现及查体(包括言语、运动、感觉、认知及情感)、NIHSS、BI、FCA评分及影像学分析提示:失语、神经功能、认知功能、情感方面及梗塞面积大小均有不同程度的改善,而且对患者的伴有疾病(糖尿病、混合型痴呆、带状疱疹后神经痛)亦有一定的疗效。4、结论1.采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能够成功在体外扩增BMSCs,在体外扩增的BMSCs具有均一的表面标志。2.BMSCs治疗缺血性脑卒中无明显不良反应,安全性好;有一定的疗效,但需进一步临床观察。