论文部分内容阅读
多氯联苯(PCB)因具有抗氧化,耐酸碱,耐热性等特点而在工业生产中应用广泛,但由于PCB对人类的危害和致癌性,导致其被禁止生产。PCB的生物整治被认为是具有前景的方法,然而高浓度的联苯和PCB会影响微生物的生长,抑制细胞分裂,并在代谢过程中积累有毒化合物。红球菌Rhodococcus sp.R04菌株是一株可以高效降解联苯及多氯联苯的菌株,本课题组以前的研究表明,红球菌R04随着联苯及多氯联苯浓度的增大,细胞丝状化现象明显,且细胞隔膜形态异常,转录组测序也表明,细菌分裂蛋白FtsZ(Filamentous temperature-sensitive gene Z)的表达量逐渐下调。为了研究红球菌R04分裂蛋白FtsZ的功能,我们构建了细胞分裂基因ftsZ的融合表达质粒,将质粒转化到大肠杆菌BL21细胞中进行表达。结果表明,空载体pET-21a的大肠杆菌细胞形态在IPTG诱导前后没有发生变化,表达红球菌FtsZ蛋白的大肠杆菌细胞在IPTG诱导前形态与其类似,而经过在IPTG诱导后大肠杆菌细胞出现菌丝状且细胞的菌丝化程度与IPTG浓度呈剂量效应关系。通过统计分析不同诱导浓度下培养不同时间的菌丝体长度,我们发现培养时间越长,菌丝体长度越大,生长5h后菌丝体长度能达到46.2μm。这说明了红球菌R04的分裂蛋白FtsZ在过表达后破坏了大肠杆菌体内分裂蛋白的分裂活动,使其对宿主细胞分裂造成干扰,导致大肠杆菌细胞不能形成正常分裂位点,因此最后分裂形成了菌丝状细胞。FtsZ是细菌分裂关键蛋白,存在于大多数原核生物中。为了揭示FtsZ蛋白在细菌分裂中承担的角色,本文以红球菌Rhodococcus sp.R04菌株的分裂蛋白基因ftsZ作为研究对象,对其在体内的定位方式进行了研究。将ftsZ基因和gfp基因插入到pK18mobsacB载体上构建红球菌R04重组载体,通过流式细胞分选仪筛选得到绿色荧光标记的R04细胞,采用荧光显微镜观察发现荧光呈弧状或点状分布在细胞内和细胞膜上,且在联苯培养下细胞中荧光显著,这有利于研究联苯代谢反应,而且对红球菌体内Z环定位的研究和FtsZ分裂机制方面的研究提供参考。应用染色体步移技术研究红球菌R04突变菌株的重组类型,结果表明gfp基因重组于红球菌R04基因组上。为研究突变菌株生物学特性,使用荧光分光光度计测量突变菌株在OD600下的生物量,发现在与野生菌株相比,突变菌株到达对数期的时间延长,生长速率减缓,结果说明外源gfp基因影响了红球菌R04菌株正常的生长代谢。