研究背景DNA甲基化是一种可被检测的表观遗传学改变,与传统病理发现癌变的阶段不同的是,DNA甲基化发生在肿瘤形成的初始阶段。异常的DNA甲基化在沉默肿瘤调节基因中起关键作用,从而对细胞周期调控、细胞凋亡以及肿瘤的发生发展过程产生重要的影响。因此,肿瘤相关基因的甲基化指标有望成为恶性肿瘤早期诊断甚至预后的生物标记物。Septin9是Septin基因家族成员之一,它参与细胞分裂、细胞极化、囊泡运输和细胞膜重构等重要生物过程,并与肿瘤的发生发展直接相关。DNA甲基化是调节Septin9基因表达的主要机制。目前,Septin9基因甲基化已成为结直肠癌的早期诊断和预后判断的生物标记物,临床上作为结直肠癌的辅助检查。近年来研究发现,Septin9在人正常乳腺组织和乳腺癌组织中也存在明显表达差异,并且Septin9基因甲基化可能促进正常乳腺上皮细胞向转移性乳腺癌的发展,但目前国内外针对Septin9基因甲基化与乳腺癌术后复发转移的临床研究仍较少。因此,本研究试图从两部分内容进行展开,一方面在前人研究基础上验证并探讨其作为乳腺癌早期诊断标记物的潜力;另一方面则重点探讨其对乳腺癌预后的评估价值。第一部分:Septin9基因甲基化在乳腺癌的检测及其与乳腺癌临床病理因素的关系研究目的1、探讨比较Septin9基因甲基化在原发性乳腺癌组织和非乳腺癌组织中的阳性率分布情况;2、探讨并排除非乳腺癌组织中Septin9基因甲基化与其临床病理类型的相关性;3、探讨原发性乳腺癌组织中Septin9基因甲基化与其临床病理因素的关系;研究方法1、收集2014年1月至2016年12月间就诊于广东省妇幼保健院乳腺疾病防控中心的82例原发性乳腺浸润性导管癌,以及非乳腺癌患者（包括乳腺纤维腺瘤、肉芽肿性乳腺炎、正常乳腺组织）37例作为对照;2、采用亚硫酸盐转化及荧光定量甲基化特异性PCR（q MS-PCR）技术分别对82例乳腺癌和37例非乳腺癌组织样本进行Septin9基因甲基化检测;3、通过卡方检验、非参数检验等计算分析Septin9基因甲基化在乳腺癌与非乳腺癌组织中的对比研究,以及其与各临床病理信息的相关性。研究结果1、乳腺癌和非乳腺癌组织中Septin9基因甲基化的比较:乳腺癌组织中Septin9基因甲基化的阳性率为52.4%（43/82）,显著高于非乳腺癌组织的16.2%（6/37）,差异具有统计学意义（x2=13.811,P=0.000）;Septin9基因甲基化分数的分布同样存在显著差异（Mann-Whitney秩和检验P<0.0001）。2、非乳腺癌组织中Septin9基因甲基化与其不同病理类型的相关性:非乳腺癌组织中Septin9基因甲基化在乳腺纤维腺瘤、肉芽肿性乳腺炎以及正常乳腺组织间均无统计学差异（P>0.05）,三种组织的甲基化阳性率分别为11.2%（2/18）、25%（2/8）、22.2%（2/9）。3、乳腺癌组织中Septin9基因甲基化与其临床病理特征的相关性:82例乳腺癌组织中Septin9基因甲基化与其患者的发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况、ER、PR、HER-2、Ki-67表达情况、分子分型、组织学分级以及脉管侵犯情况均无显著相关性（P均>0.05）。第二部分:Septin9基因甲基化与乳腺癌预后相关性的初步研究研究目的1、探讨比较Septin9基因甲基化在乳腺癌复发转移组和无复发转移组间的阳性率分布情况;2、探讨原发性乳腺癌组织中Septin9基因甲基化对乳腺癌患者临床预后的预测能力。研究方法1、收集2014年1月至2016年12月间就诊于广东省妇幼保健院乳腺疾病防控中心的389例乳腺癌患者的临床病理信息,随访至2019年12月31日,筛选出发生复发或转移的乳腺癌患者38例,根据纳入标准和排除标准,以及时间段、随访年限、发病年龄来配对选择无复发转移患者44例;2、采用亚硫酸盐转化及荧光定量甲基化特异性PCR（q MS-PCR）技术对收集的82例乳腺癌组织样本进行Septin9基因甲基化检测;3、通过Cox回归模型、生存曲线分析等分析验证Septin9基因甲基化与乳腺癌患者预后的相关性,采用ROC曲线并计算曲线下面积（AUC）来评估不同预后危险因素的检验效能。研究结果1、乳腺癌组织中复发转移组和无复发转移组Septin9基因甲基化的比较:82例乳腺癌组织中,38例出现局部复发或远处转移,另外44例为无复发转移组。复发转移组Septin9基因甲基化阳性率为71.1%（27/38）,而无复发转移组的Septin9甲基化阳性率为36.4%（16/44）（x2=9.838,P=0.002）,两组间差异具有统计学意义;而复发转移组中,不同乳腺癌复发患者与不同远处转移患者间的Septin9基因甲基化阳性情况并无差异（x2=0.806,P=0.848）。2、乳腺癌术后复发转移风险的预后影响因素分析:根据单因素和多因素Cox比例风险回归模型筛选得出,肿瘤大小、淋巴结转移、PR表达、以及乳腺癌组织中Septin9基因甲基化,是影响乳腺癌术后复发或转移的独立危险因素;乳腺癌组织中发生Septin9基因甲基化阳性者的复发转移风险是Septin9基因甲基化阴性者2.563倍（95%CI=1.252-5.248,P=0.010）。3、乳腺癌组织中四组预后独立危险因素的无病生存率比较各组生存曲线分析显示,肿瘤>2cm、腋窝淋巴结转移、PR表达阴性以及Septin9基因甲基化阳性均与乳腺癌患者较差的DFS显著相关（Log-rank P均<0.05）;其中,Septin9基因甲基化阴性组与阳性组3年DFS的累积生存概率分别为71.8%和48.8%。4、探讨Septin9基因甲基化的预后检验效能:在预后预测方面,乳腺癌组织中Septin9基因甲基化检测评估预后的敏感性为71.1%,特异性为72.7%,阳性预测值为69.2%,阴性预测值为74.4%;Septin9基因甲基化联合肿瘤大小、腋窝淋巴结转移和PR表达的敏感性分别为94.7%、94.7%、97.4%。四项预后危险因素的ROC曲线比较中,乳腺癌组织中Septin9基因甲基化检测对预后预测的能力最高,其AUC为0.719（95%CI=0.606-0.832,P=0.0007）;Septin9基因甲基化分别联合肿瘤大小、腋窝淋巴结转移以及PR表达预测预后的AUC分别为0.783、0.802、0.808（P均<0.0001）,甚至四项危险因素总体联合的AUC可高达0.883（95%CI=0.848-0.958,P<0.0001）。研究结论1、Septin9基因甲基化在乳腺癌和非乳腺癌组织中的表达有显著性差异,但乳腺癌组织中Septin9基因甲基化与患者的发病年龄、绝经状态、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、ER、PR、HER-2、Ki-67表达情况、分子分型、组织学分级以及脉管侵犯情况均无显著相关性;2、Septin9基因甲基化是评估乳腺癌临床预后风险的独立预测指标之一,联合其他预后危险因素可提高预后预测的综合能力。