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2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconicacid,2KGA)是一种重要的有机酸,它是合成D-异抗坏血酸及其钠盐的重要中间体。在工业生产中,淀粉水解糖是生产2KGA的主要原料。大米淀粉水解糖中除了含有高浓度的葡萄糖(大于230g·L-1)外,还含有少量的游离态蛋白质,可作为菌体生长的氮源。基于大米淀粉水解糖这一特性,本课题将2KGA发酵法与静息细胞转化法结合在一起,建立一种新的2KGA生物转化方法,以取代现行的发酵法,从而达到节能降耗、提高生产效率、降低生产成本的目的。主要结论如下:
(1)建立了HPLC法定量检测2KGA的方法。2KGA的紫外最大吸收波长为194nm,选择2KGA的检测波长为216nm,保留时间为3.738min,线性回归方程为Y=1.5818X-0.0354(R2>0.9999),线性范围1.0g·L-1~20.0g·L-1;精密度的RSD为0.14%,稳定性的RSD为2.15%,重现性的RSD为0.25%,2KGA平均回收率为99.42%、RSD为0.16%。
(2)对转化培养基的灭菌条件、荧光假单胞菌AR4种子培养过程以及菌体培养时间对菌体细胞产酸性能的影响进行了研究。实验结果表明,转化培养基在108℃、15min条件下灭菌,2KGA转化率最高,达到了90.72%;菌体细胞的种龄为18h。
(3)对荧光假单胞菌AR4直接利用大米淀粉水解糖合成2KGA的条件进行了研究。实验结果表明,初始细胞浓度、转化温度、底物浓度、摇瓶装液量、转化时间、转化培养基初始pH值对2KGA的合成均有显著影响;2KGA合成的适宜条件为:初始细胞浓度2.0g·L-1、转化温度30℃、底物浓度180g·L-1、500mL三角瓶装液量40mL、初始pH值7.0。在此条件下,2KGA平均产量、平均生产强度和平均转化率分别为180.79g·L-1、2.83g·L-1·h-1和93.19%,分别比分批发酵法高出6.86g·L-1、0.11g·L-1·h-1和3.00%。实验结果还表明,荧光假单胞菌AR4菌体细胞具有较好的重复利用稳定性和低温保藏稳定性。
(4)荧光假单胞菌AR4直接利用大米淀粉水解糖合成2KGA的转化过程大致可以分为两个阶段:第一阶段,菌体快速生长,2KGA随着葡萄糖的消耗逐渐积累;第二阶段,氮源物质消耗殆尽,菌体基本停止生长,菌体细胞浓度基本稳定,菌体细胞继续利用葡萄糖快速合成2KGA至葡萄糖消耗殆尽为止。
(5)对2KGA生物转化过程的动力学进行了研究,建立了动力学模型。实验结果表明,所建立的菌体生长动力学模型、2KGA生成动力学模型和葡萄糖消耗动力学模型均能与实验结果较好地吻合,且该模型具有较好的底物浓度适应性。