克百威是氨基甲酸酯类广谱杀虫剂,可用于防治土壤内和地面上的300多种害虫和线虫。按照中国农药毒性分级标准,克百威属高毒农药,不能用在蔬菜和果树上,因此对其的监测十分必要。纳米抗体是骆驼科动物体内重链抗体的重链可变区,是目前最小的抗原结合片段（15 k Da）,论文基于纳米抗体的免疫分析方法具有灵敏度高、易表达、稳定性强、操作简单、检测效率高等优点,是近年来农药残留分析技术的热点。本研究以克百威为研究对象,通过免疫双峰驼,构建噬菌体展示纳米抗体文库,筛选获得特异性识别克百威的纳米抗体,并建立基于纳米抗体的免疫检测分析方法,用于实际样品的检测。主要结果如下:1.抗克百威噬菌体展示纳米文库的构建、筛选及鉴定以克百威类似物BFNB-KLH为免疫原,6轮免疫后采集双峰驼的外周血,提取RNA并扩增VHH基因,构建了一个库容为1.27×10~8 cfu/m L的抗克百威纳米抗体文库,经辅助噬菌体M13K07救援后得到噬菌体展示纳米抗体库的滴度为1011pfu/m L。通过抗原-抗体固相吸附技术和药物竞争洗脱的方法进行了4轮淘筛,间接竞争ELISA方法鉴定选取阳性克隆。筛选得到9种不同序列的纳米抗体,其中,纳米抗体Nb316对克百威的抑制率最高,可达到95.3%,用于后续的研究。2.抗克百威纳米抗体的制备及性能分析将pComb3Xss-Nb316质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,1 m M的IPTG诱导条件下表达纯化获得纳米抗体Nb316,其表达量为2 mg/L。热稳定性分析表明,纳米抗体Nb316在95℃下孵育1小时,与抗原的结合活性始终能保持在100%左右。有机溶剂耐受分析发现,甲醇浓度低于25%时,纳米抗体Nb316与包被原的结合活性可以保持在100%以上,甲醇浓度为50%时,结合活性仍有50%。乙腈浓度低于20%时,纳米抗体的结合活性不会降低,浓度为30%时纳米抗体仍具有50%的结合活性。ELISA法测定纳米抗体Nb316的亲和力,其亲和力常数为1.06×10~6 L/mol。3.基于纳米抗体的克百威IC-ELISA方法建立建立了基于纳米抗体Nb316检测克百威的ic-ELISA方法,方法的IC50为7.27±0.88 ng/m L,线性范围为1.44 ng/m L-30.40 ng/m L,最低检测限为0.65±0.24 ng/m L。纳米抗体Nb316与丙硫克百威、仲丁威、丁硫克百威、3-羟基克百威和异丙威的交叉反应率分别为5.0%、3.5%、2.6%、2.0%和0.4%,与其余7种氨基甲酸酯类农药交叉率低于0.1%。蔬菜、水果的添加回收实验表明:大白菜的平均回收率在92.2%-104.0%之间,黄瓜的平均回收率在92.5%-102.3%之间,橙子的平均回收率在82.3%-87.5%之间,变异系数均在10%以内,回收率和稳定性均符合农药残留分析的要求。UPLC-MS/MS的检测结果与ic-ELISA方法相关系数达到0.9913,说明本论文建立的ic-ELISA方法精准度良好,可以用于克百威的实际样品检测。4.铁蛋白展示纳米抗体的制备及性能分析将Nb316基因通过重叠延伸替换Ferritin的ε螺旋并构建到pET 15b载体,转化至大肠杆菌transetta（DE3）中,表达并纯化得到铁蛋白展示的纳米抗体蛋白,表达纯化后的Ferritin-Nb316虽包含部分杂带,但相较Nb316表达量有所提升。ELISA法测定Ferritin-Nb316抗体的亲和力,亲和力常数为2.01×10~6 L/mol,比纳米抗体Nb316亲和力提高了将近一倍。