论文部分内容阅读
干旱是农业可持续发展的主要限制因素,解决干旱问题的重要途径之一就是提高作物自身的抗旱性。硫作为作物所必需的营养元素,在作物的生长代谢过程中起着许多重要的作用,有利于植物对干旱逆境的适应。玉米在世界的粮食生产中一直占有很重要的地位。研究证明,硫营养可以减轻干旱对玉米造成的伤害,而且对玉米产量的提高具有促进作用。植物体硫代谢途径中,硫酸盐转运蛋白(sulfate transporter,ST)和ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS)是最初的两个基础调控位点,γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-Glutamoyl cysteine synthetase,γ-EC)是硫营养代谢旁路中的重要酶,是谷胱甘肽合成中的关键限速酶,是作物中清除过氧化氢、有机毒物、降低重金属污染和提高作物抗性的重要酶类。对它们进行研究可以为进一步了解作物抗旱机制奠定基础。本试验以农大108玉米为供试材料,用Hoagland缺硫营养液培养玉米至3叶期,以PEG6000模拟干旱胁迫,采用分子生物学技术,取得主要试验结果如下:1.用RT-PCR方法从玉米根系总RNA中获得硫酸盐转运蛋白(ST)、ATP硫酸化酶(ATPS)及γ-EC合成酶的cDNA,分别命名为ST-ND108、ATPS-ND108和EC-ND108。并将玉米硫酸盐转运蛋白基因在GenBank上注册(登录号EF680841)。2.对得到3种基因进行序列分析,结果表明ST-ND108序列长度为2033bp,包含完整的ORF,与已报道的玉米硫酸盐转运蛋白(AF355602)同源性为99%,具有典型的植物高亲和性硫酸盐转运蛋白结构;ATPS-ND108序列长度为888bp,位于玉米ATP硫酸化酶的全长cDNA的第658到1545之间,包括完整的3`-端读码框,为典型的质体ATPS基因片段;EC-ND108序列长度为1224bp,与已报道的玉米γ?EC合成酶基因(EU969765.1和BT039328.1)相似性均为99%,仅在第623位与这两序列不同(G→T),并分析其为包括完整ORF的根系γ?EC合成酶cDNA。3.构建了玉米ST-ND108和ATPS-ND108的原核表达体系,并实现了玉米ATPS蛋白多肽片段在大肠杆菌中的表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌BL21-pET28-ATPS主要以包涵体形式表达,经BandScan5.0分析,目的蛋白约占总菌体蛋白的52.4%。本研究在干旱胁迫、无硫处理下从玉米幼苗根系中克隆到了硫酸盐转运蛋白、ATPS和γ-EC合成酶基因,构建了原核表达体系,并原核表达了ATPS基因的3`-端序列,回收后拟制备抗体,为揭示硫营养和玉米抗旱之间的联系及研究玉米的耐旱生理机制提供试验基础。