【摘 要】
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长期的棉花生产实践表明挖掘抗性基因能有效防治棉花黄萎病,挖掘抗病相关基因并解析其抗病机制,对棉花抗病分子育种意义重大。前期通过VIGS技术初步证明棉花GhBsr-k1基因负调控了棉花的广谱抗病性。为最终明确Bsr-k1基因在植物中的抗病功能,需要在稳定的Bsr-k1基因突变体材料的基础上做进一步的深入研究。因此本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术与棉花叶皱缩病毒CLCrV介导的VIGE技术
【基金项目】
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国家重点研发计划项目“棉花品质、抗逆等重要性状的功能基因组与调控网络”（项目编号:2016YFD0101006）课题主持人:刘晓东教授（新疆农业大学）；
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长期的棉花生产实践表明挖掘抗性基因能有效防治棉花黄萎病,挖掘抗病相关基因并解析其抗病机制,对棉花抗病分子育种意义重大。前期通过VIGS技术初步证明棉花GhBsr-k1基因负调控了棉花的广谱抗病性。为最终明确Bsr-k1基因在植物中的抗病功能,需要在稳定的Bsr-k1基因突变体材料的基础上做进一步的深入研究。因此本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术与棉花叶皱缩病毒CLCrV介导的VIGE技术创制拟南芥和棉花突变体材料,为明确Bsr-k1基因的抗病功能和在棉花抗病育种中评估其应用价值提供关键的遗传材料。本研究主要结果如下:（1）克隆了 GhBsr-kl 和AtBsr-k1/A tSKI3基因,GhBsr-k1 蛋白和 AtBsr-k1/AtSKI3 蛋白均存在TPR结构域且Bsr-k1蛋白在不同物种中高度保守;同时生物信息学表明它们有许多相似之处,可能具有相似的生物学功能。表达模式分析表明GhBsr-k1和AtBsr-k1/A tSKI3基因均响应棉花黄萎病的侵染。（2）基于棉花GhBsr-k1基因构建了 6个基因编辑载体,其中2个基因编辑载体实现了对棉花GhBsr-k1基因的靶向编辑,筛选获得了两个有效的sgRNA;探究了 CLCrV载体的承载力,结果表明承载完整CRISPR/Cas9基因编辑系统组件的CLCrV载体难以在棉花中实现有效地基因编辑。（3）通过传统的植物组织培养技术,采用农杆菌侵染下胚轴将pRGEB32-GhU6.7基因编辑载体转化棉花,获得GhBsr-k1基因编辑的棉花突变体材料。基于课题组前期在棉花中建立的CLCrV介导的VIGE技术,针对棉花GhBsr-k1基因,探究了成花素FT基因融合到GhBsr-k1-sgRNA的3’端的基因编辑效率及其可遗传性,结果表明融合到sgRNA的3’端的基因编辑效率要高于融合到5’端的基因编辑效率。后代基因编辑的可遗传性正在进行中。（4）构建了AtBsr-k1/AtSKI3-pHEE401基因编辑载体,浸花法转化拟南芥,获得了T1代阳性植株。通过PCR产物直接测序和高通量测序,筛选获得AtBsr-k1/AtSKI3基因编辑的拟南芥植株,为后续研究Bsr-k1基因在广谱抗病和育种中的价值提供了材料基础。本研究获得了 3株GhBsr-k1基因编辑的棉花突变体和10株AtBsr-k1/AtSKI3基因编辑的拟南芥突变体植株,为明确Bsr-k1基因的抗病功能及其在棉花育种中的价值提供了材料基础。
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