抗菌肽是生物体内先天免疫防御系统的重要组成部分,而LL-37是人体内发现的唯一一种Cathelicidin类抗菌肽。LL37具有广谱的抗茵活性,其次还有趋化作用、中和内毒素作用以及调控细胞凋亡等作用。本文的目的是在毕赤酵母中异源表达人源化抗菌肽LL37。本文首先构建了在毕赤酵母中分泌表达LL37的菌株,发现在5-L生物反应器上诱导到10 h时酵母全部死亡。为解决抗菌肽对酵母的杀伤作用,提高表达量,本文进行了四个方面的尝试研究。(1)设计了发酵与膜过滤耦合系统,分别尝试过每6 h过滤一次以及每10h过滤一次,均没有检测到产物。说明通过这种发酵与分离耦合的方式无法有效解决该问题。(2)将抗菌肽LL37定位到过氧化物酶体中表达,使得有毒的抗菌肽与细胞内的其他细胞器以及细胞膜隔开,可能会缓解抗菌肽对细胞的毒害作用。在5-L生物反应器上诱导到36h时可以检测到抗菌活性,抗菌活性随着诱导时间的增加无显著变化。为模拟毕赤酵母过氧化物酶体中蛋白的提取,构建了GFP(绿色荧光蛋白)与LL37在过氧化物酶体中融合表达的菌株,相对于提取前的绿色荧光蛋白,在上清中只检测到19.6%的绿色荧光蛋白,说明大多数的蛋白都没有提取出来。(3)分别构建了在毕赤酵母中分泌表达的2、4、6、8倍体菌株。在500 m1挡板瓶中和5-L生物反应器中使用甲醇诱导发现,菌株无法在甲醇中正常生长,说明多倍体也具有很强的杀伤作用。(4)为抑制抗菌肽对酵母的杀伤作用,尝试构建了GFP与LL37融合表达、以肠激酶和酸位点连接的两种菌株,利用G418筛选了不同拷贝数的菌株。在5-L生物反应器上发酵发现高拷贝菌株表达的融合蛋白对酵母有很强的杀伤作用,而低拷贝菌株对酵母的杀伤作用较小,使用镍柱纯化了该融合蛋白,并进行了、Vestern blot验证。