【摘 要】
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白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)是分子量为15 kDa的糖蛋白,在体内由T细胞产生,通过促进T细胞的增值,增强人体的免疫能力。为提高IL-2在体内的半衰期,实验室构建了携带有IL
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白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)是分子量为15 kDa的糖蛋白,在体内由T细胞产生,通过促进T细胞的增值,增强人体的免疫能力。为提高IL-2在体内的半衰期,实验室构建了携带有IL2-HSA融合蛋白编码基因的质粒pPIH,并在Pichia pastoris KM71中表达。本研究在此基础上,通过三种溶氧控制策略和甲醇诱导条件的改变,试图在5L罐中,探索提高产物表达量的最优条件,结果证明已构建的P. pastoris KM71/pPIH,产物的最大表达量为44 mg/L,该菌株生产潜力小。构建了3株不同宿主的IL2-HSA表达菌,P. pastoris GS115/pPIH、P. pastoris KM71/pPIH、P. pastoris SMD1168/pPIH。对其诱导条件优化后,在各自的最优表达条件下进行比较发现,GS115最适合表达IL2-HSA融合蛋白,其摇瓶表达量为314 mg/L,分别是KM71,SMD1168表达量的2.7倍和2.9倍。对三株菌的发酵上清进行Western Blot验证,结果显示,81 kDa处的条带可以与HSA和IL2两种抗体都发生免疫反应,且分子量与理论计算相符,认为是完整的IL2-HSA蛋白。发酵清液经脱盐、冻干保存,取干粉复溶后,用CTLL-2/MTT法测得粗蛋白的IL-2生物学活性为1.05×106 IU/mg。最后根据密码子的偏爱性以及IL-2的结构特性,本研究对天然IL2编码序列进行了优化,用高频密码子替换其中低频密码子,并将第125位游离Cys点突变为Ala。构建了融合蛋白HSA-IL2m的表达菌P. pastoris GS115/pPHIm,对其诱导条件进行初步优化,其摇瓶产量为144 mg/L。发酵清液经脱盐、冻干保存,取干粉复溶后测得粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×106 IU/mg。
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