病毒性疾病严重威胁人类健康。虽然目前已开发出多种靶向病毒生活周期的核酸或蛋白的化合物,但由于病毒的高突变性及高度寄生特性使其非常容易产生对靶向病毒的抗体治疗和化学药物治疗的耐受。G蛋白偶联受体(GPCR)作为生物体内最大的膜受体家族有50%左右的临床药物直接或者间接靶向GPCR。近年来,越来越多的证据表明GPCR在病毒感染过程中发挥了十分重要的作用,然而相对于数量庞大的GPCR家族成员,关于GPCR在病毒感染中的研究才刚刚起步。迫切需要建立有效的筛选机制,对GPCR在病毒感染中的关键作用进行系统分析,为靶向GPCR的抗病毒药物研发奠定良好的基础。为此,本研究尝试分别通过CRISPR-Cas9-sgRNA文库负向筛选促进病毒感染的GPCR和基因芯片技术正向筛选干扰素诱导型GPCR,分别从功能和表达谱的角度筛选在病毒感染中具有重要功能的GPCR。本文首先利用CRISPR-Cas9-sgRNA文库感染宿主细胞,通过建立不同GPCR敲除的细胞克隆,负向筛选促进病毒感染的GPCR,并最终通过对VSV病毒感染耐受细胞的基因组测序和分析发现了可能在VSV感染中发挥重要作用的LGR4。并在此基础之上,利用Lgr4基因敲除的小鼠,在动物体内和细胞体外的角度验证了 Lgr4在VSV感染中的重要作用。结果表明:Lgr4的敲除可明显抑制VSV的感染,并显著提高基因敲除小鼠对于致死剂量VSV感染的耐受。而在RAW264.7中过表达Lgr4可以促进VSV的感染。进一步的分子机制研究发现,Lgr4以一种免疫系统非依赖的方式特异性的促进了 VSV病毒对宿主的感染。VSV短时感染实验发现,Lgr4缺失细胞表面的VSV明显低于野生型细胞。提示Lgr4可能作为细胞表面受体参与了 VSV病毒的入侵过程。通过细胞入侵实验,免疫共沉淀,表面等离子共振等手段我们确定,VSV通过Lgr4胞外端入侵易感细胞。而且,用Lgr4抗体和配体R-spondin 1封闭Lgr4的胞外端可以阻止VSV的入侵,而用纯化的Lgr4胞外端预孵育VSV后也可以封闭VSV与细胞的结合从而降低VSV的入侵。因此,本部分研究不仅丰富了 VSV的入侵致病机理,还可为VSV作为基因治疗和溶瘤病毒改造提供应用,同时也证实CRISPR-Cas9-sgRNA文库的强大基因筛选功能,为今后其他病毒感染关键基因的筛选有借鉴意义。本文第二部分的工作主要利用基因芯片的方式筛选干扰素诱导表达的关键GPCR,并从中发现了具有重要抗病毒功能的GPR109A。首先利用基因芯片技术在IFN处理后的PBMC中筛选得到了多个上调表达明显的GPCR。在此基础之上在PBMC-M和小鼠来源的腹腔巨噬细胞中,通过IFN刺激和病毒刺激后,在RNA水平和蛋白水平确认GPR109A是一种重要的干扰素诱导基因。进而通过病毒感染后的子代病毒产生情况发现Gpr109a敲除巨噬细胞中子代病毒产出增高,同时在293T中过表达人源GPR109A,可明显抑制子代病毒的产出,说明在细胞层面,GPR109A确实发挥抵抗病毒感染的功能。同时通过小鼠致死剂量病毒感染模型发现,Gpr109a敲除小鼠致死率高于野生型小鼠。而且Gpr109a敲除小鼠腹腔细胞的病毒感染率增高,同时,在腹腔各器官的研磨液中病毒滴度增高,进一步确认Gpr109a在小鼠体内同样发挥抵抗病毒感染的功能。为进一步明确GPR109A的抗病毒分子机制,我们对基因敲除小鼠组织和细胞中IFN含量进行检测却发现,GPR109A敲除可以显著抑制IFN的胞外释放。通过免疫印迹和透射电镜我们都观察到Gpr109a缺失抑制自噬的形成,进而在Gpr109a敲除细胞中激活自噬可回复IFN的产量。从而确定了 Gpr109a作为代谢受体,通过自噬影响了 IFN释放从而抵抗病毒感染。为进一步探索Gpr109a的药用价值,使用其配体烟酸发现,烟酸可通过Gpr109a激活自噬小体的形成同时增强IFN的释放从而体内体外组织水平均可抵抗病毒感染。提示GPR109A可作为调控IFN抵抗病毒感染的重要靶点,具有潜在的应用开发前景。综上所述,CRISPR-Cas9-sgRNA文库高通量负筛选发现了 LGR4,可作为VSV入侵受体。ISGs基因芯片正筛选发现了 GPR109A,可通过自噬调控IFN的释放抵抗病毒感染。不仅对后人利用CRISPR-Cas9-sgRNA文库筛选基因具有借鉴意义,同时又证明了 GPCR在病毒感染过程中发挥了重要功能,为新型靶向GPCR的抗病毒药物研发,从宿主免疫方面设计药物提供了理论依据。