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目的：子痫前期（Pre-eclampsia,PE）是妊娠期特有的多系统、进展性疾病,于妊娠中晚期发病,是孕产妇、围产儿病死率升高的主要原因之一。虽然子痫前期的具体的发病机制仍不明确,但是滋养层细胞浸润不良、螺旋小动脉重塑障碍是学界较公认的病理机制。目前已鉴定出的170余种RNA化学修饰,其中N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰是真核生物中RNA（mRNA、lnc RNA）转录后最常见的修饰方式。m6A修饰位点附近的序列具有高度保守性的特点,mRNA上m6A修饰主要发生在DRACH（其中D对应A,G或U;R对应G或A;H对应A、C或U）这种特殊位点的动态修饰受甲基转移酶（Methyltransferase,Writer,也称修饰酶）及去甲基化酶（Demethylase,Eraser,也称去修饰酶）动态可逆调控,m6A修饰的RNA可被甲基结合蛋白（Reader,也称识别蛋白）识别,m6A修饰在细胞中的功能众多,现已知其参与干细胞分化、生长发育、DNA损伤修复、热休克反应、肿瘤发生、免疫反应等多种生命活动。子痫前期胎盘中RNA m6A修饰调节酶、m6A修饰失调影响的RNA以及可能涉及的调控通路,能够为子痫前期中RNA转录组调控机制的相关研究提供新的线索。阐明疾病发生的表型和细胞信号通路中所涉及的潜在mRNA的m6A修饰机制。本研究通过研究早发子痫前期、晚发子痫前期及对应孕周的对照胎盘,检测胎盘组织总RNA的m6A修饰水平、m6A修饰酶、m6A去修饰酶[包括m6A甲基转移酶3（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）、Wilms肿瘤1结合蛋白（Wilms’tumor-associated protein,WTAP）、甲基转移酶14（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）、脂肪量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）及Alk B同源蛋白5（Alk B Homolog 5,ALKBH5）等];以及子痫前期中滋养层细胞生物学功能变化。通过体外敲减、过表达来改变WTAP的表达,探究其对滋养层细胞系增殖、浸润、迁移能力的改变。联合RNA甲基化免疫共沉淀测序技术（MeRIP-seq）及高通量测序技术（RNA-seq）,探究WTAP敲减后滋养层细胞RNA m6A修饰变化图谱,筛选具有明显m6A修饰差异的候选基因。将WTAP敲减后“差异m6A修饰水平”和“差异m6A修饰量”的表达同向下降的基因中的卷曲蛋白受体2（frizzled class receptor 2,FZD2）作为候选基因,验证WTAP参与测序候选基因中FZD2 mRNA的m6A修饰调节。本研究相关内容将为进一步阐明RNA甲基化m6A修饰参与早发子痫前期的病理生理机制提供重要实验证据。方法：1、早发子痫前期、晚发子痫前期及对应孕周的对照胎盘m6A修饰水平、m6A修饰酶的检测:（1）收集早发子痫前期、晚发子痫前期及对应孕周的对照胎盘组织标本;（2）采用比色法、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测早发、晚发子痫前期及对应孕周胎盘组织总RNA的m6A修饰水平、甲基转移酶（METTL3、METTL14、WTAP）、去甲基化酶（ALKHB5和FTO）,利用生物信息学手段与公共数据库信息进行比较,筛选与子痫前期相关的关键甲基化修饰相关基因。（3）LIN28B/let-7a-2-3p过表达、敲减后,细胞中m6A修饰酶WTAP的表达。2、滋养层细胞系HTR-8/SVneo敲减WTAP后,m6A表观转录组信息概况和RNA测序与MeRIP测序的关联分析:（1）选择WTAP敲减及对照组进行MeRIP高通量测序,检测具有显著m6A修饰差异的mRNA基因（Fold change＞1.5、P＜0.05）及其富集情况（“差异m6A修饰水平”和“差异m6A修饰量”）;（2）采用RNA高通量测序技术,筛选WTAP敲减及对照组中明显差异化表达的基因;（3）通过RNA-seq与MeRIP-seq联合分析受m6A修饰调控的mRNA（“差异m6A修饰水平”、“差异m6A修饰量”同向下调且RNA-seq基因表达水平改变）,作为候选基因集;3、WTAP调控的m6A修饰变化对滋养层细胞系HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞增殖、浸润、迁移能力的改变表型的影响:（1）构建小干扰si-RNA及过表达慢病毒载体,分别转染HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞,采用Ed U、流式细胞术、WB等技术检测HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞增殖、浸润、迁移能力的改变表型及下游通路靶基因;（2）构建敲减FZD2小干扰序列,转染HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞,采用Ed U、流式细胞术、WB等技术检测HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞增殖、浸润、迁移能力的改变表型及下游通路靶基因的表达;4、统计学分析:用SPSS 26.0（SPSS,Inc.,Chicago,USA）和Graph Pad Prism 9.0软件（Graph Pad,Inc.,La Jolla,CA,USA）进行统计分析。实验至少独立重复3次。测量的数据以平均值和/或SD表示。对于两组独立正态分布的连续变量数据分析采用t检验;对于不符合正态分布的数据采用非参数Mann-Whitney检验;同时,采用χ2检验来分析分类变量数据。每项分析的P值都标在数字上,统计学意义水平被定义为P＜0.05（*P＜0.05;**P＜0.01;***P＜0.001）。结果：1、早发子痫前期、晚发子痫前期及对应孕周胎盘组织m6A修饰水平及相关酶表达的改变。（1）早发子痫前期胎盘组织总RNA m6A甲基化修饰水平低于对照组;晚发子痫前期与晚发对照未见明显差异（2）WTAP的下调可能是总RNA的m6A修饰水平在减少的原因;（3）与对照组比较,早发对照组总RNA m6A甲基化修饰水平较晚发对照组提示RNA m6A可能在胎盘的发育过程中存在时序化波动,WTAP下调参与了该疾病胎盘组织中总RNA的m6A甲基化修饰水平的调控。我们选择WTAP敲减的HTR-8/SVneo细胞系进行MeRIP测序和RNA测序。2、结合课题组前期发现的在妊娠期时序性表达,妊娠早期表达最高,随着妊娠期进展表达逐渐降低的LIN28B蛋白,探寻其对WTAP的表达的影响。（1）在早发子痫前期组织中发现,LIN28B与WTAP表达水平进行相关性比较,构建二者的表达相关性曲线,发现LIN28B与WTAP表达水平呈正相关。（2）LIN28B通过早发子痫前中高表达的Let-7a-2-3p轴对WTAP的表达let-7a-2-3p通过“mi RNA靶向靶基因”抑制WTAP的表达。（3）LIN28B过表达,共转let-7a-2-3p,let-7a-2-3p能够抑制LIN28B对WTAP的正向调控。3、HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞系中,敲减WTAP下调能够抑制滋养细胞增殖、浸润、迁移能力。HTR-8/SVneo细胞系RNA测序与MeRIP测序的联合分析结果（1）敲减的HTR-8/SVneo细胞系中所检测共鉴定出mRNA m6A甲基化水平下降的基因132个、mRNA m6A甲基化绝对量下降的基因2812个;发现mRNA m6A甲基化水平上升的基因32个、mRNA m6A甲基化绝对量上升的基因507个,mRNA m6A甲基化水平和mRNA m6A甲基化绝对量均下降的共104个,包括PEG10、RAB18、MCM5、NAXD、FZD2等。（2）RNA-seq和MeRIP-seq关联分析显示,在104个mRNA m6A甲基化水平和mRNA m6A甲基化绝对量均下降转录本中有45个表达下调,3个表达上调。（3）GSEA基因富集发现,敲减的HTR-8/SVneo细胞系中,WNT结合蛋白基因集富集下调,显著降低。（4）结合子痫前期公共数据库,发现mRNA m6A甲基化水平和mRNA m6A甲基化绝对量均下降的转录本中FZD2下调最为显著,确定为候选分子。（5）滋养层细胞HTR-8/SVneo、SWAN-71细胞系中发现FZD2受到WTAP的调控,呈正相关,FZD2在WTAP敲减后,mRNA稳定性显著降低,FZD2下调能够抑制滋养细胞增殖、浸润、迁移能力。4、WTAP调控的m6A修饰作用的RUPP子痫前期大鼠体内验证（1）构建RUPP子痫前期大鼠,大鼠胎盘中Wtap、Fzd2表达显著降低。（2）RUPP模型大鼠中,于E14.5胎盘显微注射,组织靶向过表达Wtap慢病毒进行,胎盘中Wtap基因的表达可以显著改善子痫前期大鼠症状。结论：1、早发子痫前期胎盘组织总RNA m6A甲基化修饰水平显著低于孕周匹配对照组,RNA m6A甲基化修饰水平与早发子痫前期的发病之间存在一定的联系。WTAP下调作为主要的甲基转移酶参与了总RNA的m6A甲基化修饰水平的调控。2、WTAP在滋养层细胞中受到LIN28B/let-7轴调控,参与RNA m6A可能在胎盘的发育过程中波动。3、WTAP参与滋养层细胞增、迁移、浸润、能力改变,通过MeRIPseq及RNA-seq联合分析发现,WTAP表达下调后,“WNT结合蛋白”富集下调,其中FZD2作为关键基因参与其中,影响滋养层细胞增、迁移、浸润能力。4、在RUPP模型大鼠胎盘中Wtap、Fzd2表达低于正常孕鼠。胎盘局部过表达Wtap基因的表达可以明显改善孕鼠的子痫前期症状,降低孕鼠血压,WTAP在早发子痫前期发病机制中发挥重要作用。