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研究背景:
阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是发生于老年人的常见的一种神经退行性疾病,脑组织中细胞外老年斑(Senile plaque,SP)的形成是AD重要的病理变化之一。SP的核心成分是β-淀粉样肽(β-Amyloid,Ap),Aβ是在β-裂解酶(β-Amyloid precursor protein cleavage enzyme 1,BACE1)和γ-分泌酶的共同作用下将β-淀粉样肽前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)切割形成的产物,因此APP及BACE1表达的增高可使Aβ产生增加,是导致AD发病的重要因素。家族性AD的发病主要和遗传有关,而散发性AD的发病机制十分复杂,其中氧化应激被认为是导致AD发病的一个早期因素,对AD患者脑组织、AD动物模型以及细胞模型的研究结果为此提供了充足的证据。近年来的研究表明表观遗传学(Epegenetics)在AD发病过程中起着重要作用,其中DNA甲基化(DNA methylation)水平的改变可影响基因的转录及蛋白的表达。有研究报道,AD患者皮层的Ⅱ层神经元基因组DNA整体甲基化水平降低,一些与Aβ生成相关蛋白基因启动子区发生去甲基化。上述研究结果表明,氧化应激这一损伤因子可能通过影响Aβ生成相关蛋白基因的甲基化水平,调节Aβ的生成,在AD早期发病过程中发挥着重要作用。
研究目的:
本实验通过观察氧化应激对Aβ生成相关蛋白基因甲基化水平的影响,探讨氧化应激在AD发病中的表观遗传学机制。
材料和方法:
培养人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞,采用H2O2、p38MAPK信号通路阻断剂SB203580、JNK信号通路阻断剂SP600125和DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-Aza-2-deoxycytidine处理细胞。
1、蛋白印迹法(westernblot)检测phospho-p38MAPK和phospho-JNK、APP和BACE1、DNMT1和DNMT3a、TACE和ADAM10的表达;
2、实时定量PCR(Q-PCR)检测BACE1mRNA的表达;
3、MassARRAY(R)EpiTYPERTMDNA甲基化定量分析技术检测APP和BACEl基因甲基化水平;
4、免疫细胞化学方法检测基因组DNA甲基化水平;
5、凝胶迁移实验(EMSA)检测核转录因子NF-κB和SP1的激活情况;
6、ELISA检测细胞内Aβ含量。
研究结果:
1、氧化应激可通过β-分泌酶途径诱导Aβ生成相关蛋白表达增高,Aβ表达增多;
培养的SH-SY5Y细胞经H2O2处理1h和72h后,BACE1mRNA水平分别增高至对照组的8.38倍和6.08倍;p38MAPK/JNK信号通路阻断剂可明显抑制BACE1mRNA表达。H2O2处理1h和72h后,APP蛋白表达分别增高了43.4%和56.2%,BACE1蛋白表达分别增高了82.8%和84.0%。SH-SY5Y细胞经H2O2分别处理1h和72h后,ADAM10蛋白表达与对照组相比分别下降了36.2%和43.2%,p38MAPK信号通路阻断剂可逆转其表达,TACE各组蛋白表达与对照组相比均无明显变化。细胞经H2O2处理24h和72h后,Aβ40的含量分别是对照组的1.4倍和2.8倍;Aβ42的含量分别是对照组的1.3倍和1.8倍。
2、氧化应激可通过抑制DNMT表达使APP和BACE1基因发生去甲基化;
SH-SY5Y细胞经H2O2处理72h后,DNMT1的表达下降至对照组的75.3%,DNMT3a的表达下降至对照组的40.3%。对APP及BACE1基因启动子区及第一外显子区富含CpG岛区域甲基化水平检测,SH-SY5Y细胞经H2O2处理72h后,与对照组相比,APP和BACE1基因甲基化水平明显降低,分别下降了约18.3%和18.6%;JNK信号通路阻断剂预先处理的细胞其甲基化水平无明显变化。
3、DNA甲基化可能影响NF-κB的激活,而SP1的激活受DNA甲基化影响较小。
EMSA结果显示,细胞经H2O2处理1h后,核转录因NF-κB明显被激活,p38MAPK/JNK信号通路阻断剂及DNMT抑制剂可抑制H2O2诱导的NF-κB的激活;细胞经H2O2处理1h后,核转录因SP1同样被激活,p38MAPK/JNK信号通路阻断剂可抑制这一激活反应;DNMT抑制剂对SP1激活无明显影响。
研究结论:
氧化应激可影响Aβ生成相关蛋白基因甲基化水平,在AD发病过程中发挥作用。