牡丹花酚类成分提取纯化及其对大肠杆菌、金黄色葡萄球生物被膜抑制活性研究

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凤丹牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.ostii)是我国特有的油料牡丹品种。除具观赏价值之外,牡丹花因其含有丰富的酚类成分,还具有抗氧化、抗炎、抑菌等作用,在食品和医药领域具有开发利用价值。为此,本文对牡丹花中的酚类成分进行了提取、纯化,并对纯化后的酚类成分进行生物被膜抑制活性分析、机理探究及食品保藏研究。主要研究内容和结果如下:牡丹花酚类成分的提取及抑菌活性和生物被膜抑制活性的测定。采用微波辅助提取(Microwave-assisted extraction,MAE)法提取牡丹花中的酚类成分,并通过响应面确定最佳提取条件为:液料比56 mL/g,提取时间331 s,乙醇体积分数56%,功率497 W。与传统液固提取法(Conventional liquid-solid extraction,CLSE)相比,MAE具有更高的酚类成分得率(49.26 mg/g)、酚类含量(12.13%)、抑菌活性(最小抑菌浓度值(Minimum inhibition concentration,MIC)为34.00 mg/m L)和生物被膜抑制活性(最小生物被膜抑制浓度值(Minimum biofilm inhibition concentration,MBIC)为20.00 mg/m L)。牡丹花酚类成分的分离纯化及抑菌活性和生物被膜抑制活性的测定。经过有机溶剂分级萃取、聚酰胺柱层析和硅胶柱层析后,得到牡丹花酚类成分硅胶柱洗脱相(Phenolics of peony flowers in the eluent of silica gel column chromatography,PPF-ESGCC),其主要成分为没食子酸(Gallic acid,GA)、山奈酚-7-O-葡萄糖苷(Kaempferol-7-O-glucoside,K7G)和芹菜素-7-O-葡萄糖苷(Apigenin-7-O-glucoside,A7G)。与粗提物相比,PPFESGCC的酚类成分含量(83.35%)提高了7倍,抑菌活性(MIC为0.88 mg/m L)提高了39倍,生物被膜抑制活性(MBIC为0.60 mg/mL)提高了33倍,结果表明酚类成分的含量与其抑菌活性和生物被膜抑制活性存在正相关性。牡丹花酚类成分硅胶柱洗脱相(PPF-ESGCC)对细菌生物被膜的抑制机理研究。亚抑菌浓度的PPF-ESGCC能够有效抑制大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)生物被膜的形成,且在0.44 mg/m L时,其抑制率分别达77.93%和87.03%。同时,研究发现PPF-ESGCC可通过调控细菌的群体感应系统、抑制细菌的运动性、减少胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)的产量及降低细菌界面的疏水性(Cell surface hydrophobicity,CSH),从而达到抑制细菌生物被膜的效果。此外,在生物被膜形成的关键阶段(1~3 d),PPF-ESGCC浓度与其对生物被膜的抑制率呈正相关(r=0.9137~0.9967),与培养时间呈负相关(r=-0.8206~-0.9936)。PPFESGCC主要成分对细菌生物被膜的抑制结果表明,A7G的生物被膜抑制活性明显优于GA和K7G,A7G是PPF-ESGCC中抑制细菌生物被膜的主要成分。牡丹花酚类成分硅胶柱洗脱相(PPF-ESGCC)应用于鸡胸肉保藏。采用浓度为0.175%(w/v)的山梨酸钾和0.022%(w/v)的PPF-ESGCC复配水溶液处理鸡胸肉,通过测定鸡胸肉样品的色度值、pH值、挥发性盐基氮值(Total volatile base nitrogen,TVB-N)和微生物指标等,确定其贮藏期可达12 d。与山梨酸钾组(0.200%(w/v))相比,其贮藏期延长3 d,与对照组(蒸馏水)相比,其贮藏期延长6 d。
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