前言肝内胆管结石是发生在左右肝管汇合部以上各分枝胆管内的结石,在西方国家很少见,中国的肝内胆管结石病人在所有的这类病人中占据着非常大的比例。肝内胆管结石是一种发病率高、病情严重复杂、治疗困难、容易复发的疾病。肝内胆管结石的发生与环境因素、饮食结构、感染、胆汁淤积、寄生虫、遗传等因素密切相关。结石形成的基础是胆固醇在胆汁中呈饱和甚至过饱和状态或者是非结合胆红素在胆汁中相对增多,胆汁中的糖蛋白、金属离子等均参与结石的形成并起着非常重要的作用。肝内胆管结石可引起反复发作的胆管炎、败血症、门脉高压、肝功能损害甚至衰竭等严重并发症,还可导致肝癌,严重威胁了病人的健康和生命。但是,肝内胆管结石不是恶性肿瘤,是一类良性疾病,应该是可以防治的。第一部分胆汁糖蛋白含量测定及其意义目的通过测定胆汁中糖蛋白含量,对比肝内胆管结石病人与肝外胆管结石病人胆汁中糖蛋白含量的不同,获得更有说服力的研究结果,探讨肝内胆管结石多发、复发的相关因素,为指导病人在生活工作中如何注意相关事项以预防其发生,指导医生如何选择恰当的治疗方法以取得更好的疗效提供重要依据。材料和方法1.病人资料：选择2012年12月-2014年02月间因胆石症入院的病人38例,肝内胆管结石组病人17例,肝外胆管结石组病人21例,同期住院的非胆石症病人18例为对照组,共56例。2.标本采集：胆石症病人胆汁标本于术后(或EST后)3天通过T型引流管或鼻胆管取20ml,放置在无菌试管内进行密封保存,并放入冰箱内,设定温度为零下20摄氏度。对非胆石症病人均于术中细针穿刺胆囊取胆汁20ml,存放置在无菌试管内进行密封保存,并放入冰箱内,设定温度为零下20摄氏度。3.方法：胆汁标本解冻后,经过离心、沉淀、除盐等过程后,通过SDS-PAGE电泳跑出蛋白条带,将分子量在200KD以下的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上,再以糖蛋白测定试剂盒,采用过碘酸一席夫液试剂染色法(PAS法)进行糖蛋白定性试验。糖蛋白的定量按Lowry法,以血清白蛋白为标准,计算分子量在200KD以下的糖蛋白含量值。4.统计学处理：分别计算各组病人的胆汁糖蛋白含量,所得数据用X±S表示,以SPSS17.0软件进行统计学处理。采用独立样本实验的均值比较,方差齐则取对应方差齐的P值,方差不齐则取对应方差不齐的P值,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.关于胆汁糖蛋白含量：肝内胆管结石组病人高于肝外胆管结石组病人,肝外胆管结石组病人高于对照组病人。2.关于均值比较统计学处理：肝内胆管结石组病人与肝外胆管结石组病人两组数据间的差异具有显著性；肝内胆管结石组病人、肝外胆管结石组病人分别与对照组病人数据比较的差异均具有显著性。讨论1.研究肝内胆管结石发病机制的重要性：肝内胆管结石因其治疗困难及并发症严重可能会导致病人死亡,但是它不是恶性肿瘤,而是一类良性疾病,应该是可以预防和治愈的。因此,探索其病因及发病规律,为指导病人在生活工作中如何注意相关事项以及指导医生如何选择恰当的治疗方法提供依据就显得非常重要。2.糖蛋白在肝内胆管结石形成中的作用机制：研究发现糖蛋白的凝聚作用是胆石形成的主要因素。许多实验结果表明：一定分子量范围内的糖蛋白在胆石形成过程中起促进作用。糖蛋白或糖蛋白胆色素复合物可以作为核心,使胆固醇结晶或胆色素钙盐不断沉积而形成结石。糖蛋白分子之间互相交联在胆管粘膜表面形成胶体网状结构中,微泡的运动受到限制,微泡脱水融合,形成胆固醇结晶。糖蛋白形成的凝胶体粘性很高,胆色素分子及钙离子被粘附在凝胶体中,相互结合形成胆色素钙复合物。在糖蛋白凝胶体中,胆固醇结晶或胆色素钙盐在糖蛋白复合物或糖蛋白胆色素复合物周围不断沉积、粘附、结合而形成结石。3.糖蛋白的相关研究：很多学者通过各自的研究一致认为,糖蛋白在胆石形成过程中起着重要的作用。4本研究的特点：我们以肝内胆管结石病人为研究对象,直接用胆汁为标本测定糖蛋白含量,从深层次探讨与肝内胆管结石形成及复发相关的因素。采用SDS-PAGE电泳分离后PAS法染色,测定胆汁糖蛋白含量,这种方法是目前比较先进的测定糖蛋白的方法,经济,可靠,数据容易得出。促进胆管结石形成的糖蛋白分子量都在200KD左右以下。结论本研究结果表明胆汁糖蛋白含量与胆管结石的形成相关,而胆汁糖蛋白含量与肝内胆结石的形成关系更为密切,测定胆汁糖蛋白含量对肝内胆管结石病人具有重要的意义。第二部分胆汁钙离子含量测定及意义目的本研究通过测定胆汁钙离子含量,对比肝内胆管结石病人与肝外胆管结石病人胆汁钙离子含量的不同,获得更有说服力的研究结果,探讨肝内胆管结石多发、复发的相关因素,为指导病人在生活工作中如何注意相关事项以预防其发生,指导医生如何选择恰当的治疗方法以取得更好的疗效提供重要依据。材料和方法1.病人资料及标本采集同第一部分。2.方法：胆汁标本冻融后,在酸性铬蓝K缓冲溶液中加入胆汁标本,胆汁中的钙与酸性铬蓝K间形成一种络合物,此络合物的最大吸收波长为496 n m,用分光光度法在波长496 n m处测量酸性铬蓝K溶液吸光度减少值,能测定的钙离子含量范围为0～60mol/L。3.统计学处理：分别计算各组病人的胆汁钙离子含量,所得数据用X±S表示,以SPSS17.0软件行统计学处理。采用独立样本实验的均值比较,方差齐则取对应方差齐的P值,方差不齐则取对应方差不齐的P值,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.关于胆汁钙离子含量：肝内胆管结石组病人高于肝外胆管结石组病人,肝外胆管结石组病人高于对照组病人。2.关于均值比较统计学处理：肝内胆管结石组病人与肝外胆管结石组病人两组数据间的差异具有显著性；肝内胆管结石组病人、肝外胆管结石组病人分别与对照组病人数据比较的差异均具有显著性。讨论1肝内胆管结石的特点：肝内胆管结石在我国的发病率比较高,其发生与环境、饮食、感染等许多因素有关,其形成涉及到游离胆红素所占比例增高；结石核心的形成；糖蛋白的凝聚作用以及金属离子的参与等。主要是胆色素结石,常伴有胆汁淤积及胆道感染。临床特点为间歇性、反复性发作。其治疗比较困难,疗效不够满意。2病因机制的特殊性：肝内胆管结石主要成分是胆色素和钙。由于胆道感染等原因导致胆汁中游离胆红素所占的比例增高,可与胆汁中的钙结合,形成不溶性的胆红素钙而析出,进而形成肝内胆管结石3钙离子在肝内胆管结石形成中的作用机制研究：游离胆红素和其他物质与金属离子集结是肝内胆管结石形成的一个主要过程,并且钙离子是所有离子中的首要作用物质。钙离子与胆红素、糖蛋白分子结构中的羟基很容易结合形成不能分解的聚合物。钙离子在胆石网状结构的形成中起着离子桥的作用。4本研究的特点：我们以肝内胆管结石病人为研究对象,直接用胆汁为标本测定胆汁中钙离子含量,这是本研究的与以往相关研究的不同之处,希望从深层次探讨与肝内胆管结石形成及复发相关的因素。钙离子测定选用酸性铬蓝K分光光度法,此方法能测定胆汁中微量钙,误差很小,比较准确,方法简单易行。结论本研究结果表明胆汁钙离子含量与胆管结石的形成相关,尤其是与肝内胆结石形成关系更为密切。测定胆汁糖蛋白含量对肝内胆管结石病人具有重要的意义。小结1.肝内胆管结石介绍：肝内胆管结石在西方国家较为少见,我国的这类病人相对比较多。可引起胆管梗阻、感染,病情加重可引起肝脓肿、重症胆管炎、感染性休克。长期不愈可能导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。肝内胆管结石病人的治疗方法有肝切除术、内镜治疗、肝移植等等。肝内胆管结石的特点是发病率高、病情复杂、治疗困难、容易复发,严重影响了病人的健康甚至生命。但是,它是一类良性疾病,应该是可以预防和治愈的。2.本研究结果：肝内胆管结石是一种特殊类型的胆管结石,在结石形成机理方面既具有一般胆管结石形成的基本规律,又具有其自身的特点。3.本研究对预防的意义：对于具有肝内胆管结石高发因素同时胆汁糖蛋白、钙离子含量增高的病人,在生活工作中应特别注意习惯,饮食,环境等事项或采取一定的预防措施如应用疏肝利胆的一些药物等,尽可能减少或避免该病的发生。4.在治疗中的意义：对于胆汁糖蛋白、钙离子含量明显增高的肝内胆管结石病人,应采取更积极、确实的治疗方法；要为后续治疗预留途径；采用综合性治疗措施；做好随访。5.与相关研究的比较：很多相关研究与本研究的结果是一致的,说明了结石形成机理的一般规律。个别结果不一致,可能与地区、种族、测定方法及计算统计方法不完全一致有,但不是本质的、规律的不同,不影响本研究的结果。6.不足之处：本研究的所有过程都严格按照课题及实验设计的要求进行的,但毕竟样本量有限,实验结果尚需要多中心大样本的随机对照实验来进一步证实。