目的:可变剪接指的是前体m RNA通过不同的剪接方式产生不同的m RNA剪接异构体的过程。人类约95%的基因进行了可变剪接,这种机制对于蛋白表达的多样性具有重要意义[1],异常的可变剪接与癌症等许多疾病密切相关。可变剪接事件的发生是通过剪接位点的选择及前体RNA上增强子、沉默子等在内的的顺式作用元件招募SR蛋白、hn RNPs等反式作用因子来完成。FOXM1,全称Forkhead box protein M1,是转录因子Forkhead家族中的一员,参与细胞增殖,血管新生,细胞凋亡,氧化应激,代谢平衡,炎症[2]等生命进程,具有致癌活性。FOXM1通过可变剪接产生3种剪接异构体,分别编码a、b、c三种蛋白亚型。a亚型(含5a,7a可变剪接外显子),因其反式激活域结构的破坏而没有转录活性[3]。b亚型(不含5a和7a外显子)与c亚型(只含有5a可变剪接外显子)均有转录活性。FOXM1b是肿瘤代谢中有效的激活基因,是癌细胞中的主要亚型[4],并在软琼脂实验中比c亚型有更强的转化能力。此外,FOXM1b是肿瘤代谢中有效的激活因子,ARF介导的对FOXM1b的抑制是抑制肿瘤代谢的关键机制[5]。FOXM1b通过激活Akt-snail I通路,促进肿瘤转移有关的基因表达而促进肿瘤转移[6]。因此抑制FOXM1b的表达对肿瘤转移的治疗意义重大[7]。FOXM1c在正常细胞及癌细胞中广泛表达,并且可以被RAF/MEK/MAPK信号通路激活,这种激活能促进FOXM1c的蛋白水解。FOXM1c它可以通过直接结合两个TATA盒,也可以直接结合TATA结合蛋白与通用转录因子TFIIA,TFIIB反式激活c-myc启动子,通过此方法找到了FOXM1c新的靶基因c-myc、c-fos、热休克蛋白70等,这一发现有力地支持了FOXM1作为典型的增殖相关基因的证据[8]。FOXM1b/c亚型有重要的不同的生物学意义,因此研究FOXM1b/c亚型可变剪接的机制尤为重要,但目前其机制尚不清楚。本课题旨在验证FOXM1b/c在细胞增殖、迁移等方面的功能区别,通过确定调控FOXM1b/c表达的顺式作用元件及反式作用因子探究FOXM1b/c亚型的可变剪接机制。方法:(1)比较FOXM1b/c亚型的功能差异。在MDA-MB-231细胞中,分别构建FOXM1b及FOXM1c的稳转细胞系,进行划痕实验及平板克隆实验,分别检测细胞迁移能力,增殖能力。(2)建立检测FOXM1b/c亚型的方法。提取Hela细胞总RNA,利用RT-PCR检测FOXM1b/c亚型的表达情况,同时检测其在癌细胞系中的内源性表达。(3)找出调控b/c亚型的顺式作用元件。在报告基因水平删除嘧啶或嘌呤富集区,将其瞬转到Hela细胞中,利用RT-PCR确定能调控FOXM1b/c亚型表达的顺式作用元件。并对有调控作用的顺式作用元件采用CRISPR-Cas9技术进行内源性敲除。(4)在报告基因水平确定调控FOXM1b/c亚型的反式作用因子。克隆剪接因子,并将其与报告基因瞬时转染到Hela细胞中,利用RT-PCR筛选能调控FOXM1b/c亚型的剪接因子。(5)在细胞内源性表达水平验证反式作用因子对FOXM1b/c可变剪接的调控作用。构建稳定表达反式作用因子的细胞株,用RT-PCR检测过表达反式作用因子时能否影响细胞内源性FOXM1b/c亚型的表达。结果:(1)FOXM1b的平板克隆形成能力强于FOXM1c;FOXM1c的细胞迁移能力略强于FOXM1b。(2)删除内含子5a上的一段嘧啶富集序列P2及外显子5a、内含子5a上的特异的嘌呤富集序列P3、P5均能显著增加FOXM1b的表达;删除内含子5a上的一段特异的嘌呤富集序列P4可使FOXM1c的表达显著升高。(3)采用CRISPR-Cas9进行细胞内源性敲除P2能显著增加FOXM1b的表达。(4)在报告基因水平,过表达HNRNPF、HNRNPH能显著增加FOXM1c的表达;过表达HNRNPA1、HNRNPK、TRA2A、TRA2B能显著增加FOXM1b的表达。(5)在内源性过表达反式作用因子的Hela稳转细胞系中,TRA2B能增加FOXM1b的表达。结论:本研究证实了FOXM1b比FOXM1c有更强的平板克隆形成能力,而FOXM1c的细胞迁移能力略强于FOXM1b。在报告基因水平删除嘧啶富集区P2、嘌呤富集区P3、P4、P5能显著改变FOXM1b/c的表达,说明这几段特异序列对FOXM1b/c的表达至关重要。细胞内源性敲除P2能显著增加FOXM1b的表达,表明P2为能调控FOXM1b/c表达的顺式作用元件。在Hela细胞中,过表达剪接因子TRA2B使FOXM1b的表达内源性增加10%,提示剪接因子TRA2B为能调控FOXM1b/c表达的反式作用因子。