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研究背景:乳腺癌患者好发骨转移,骨转移可引起多种骨的并发症,严重影响患者的生存质量和生存期,阐明乳腺癌骨转移的分子机制有助于发现预测骨转移风险和治疗骨转移的新策略。叉头框转录因子F2(forkhead box F2,FOXF2)是调控胚胎发育和组织分化的关键转录调控因子,特异性表达在间质细胞中,通过促进间质细胞分化和抑制邻近上皮细胞的间质转化维持组织稳态。课题组前期研究发现FOXF2在乳腺原发癌组织中与一组骨及骨基质重塑相关基因异位共表达,且FOXF2高表达的乳腺癌患者骨转移发生率高,提示FOXF2异位高表达促进乳腺癌骨转移。进一步研究FOXF2调控乳腺癌骨转移可能的机制,发现调节骨及骨基质重塑关键信号分子骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)中BMP4是潜在的FOXF2调控靶分子。因此,我们推测FOXF2可能通过调控BMPs信号通路促进乳腺癌骨转移。目的:本研究旨在阐明FOXF2在乳腺癌骨转移中的作用及分子机制,以期发现乳腺癌骨转移风险预测的分子诊断方法和靶向治疗骨转移的新策略。研究方法:1.基于课题组和公共数据库中乳腺原发癌组织的基因表达谱数据,Pearson’s方法分析与FOXF2呈相关性表达的基因(r≥0.3);RT-QPCR方法检测乳腺原发癌组织中FOXF2与骨及骨基质重塑相关基因m RNA表达,验证FOXF2与骨及骨基质重塑相关基因表达的相关性;Kplan-Meier和Log-rank方法分析FOXF2和BMP4 m RNA表达水平与患者骨转移生存的关系;K均值聚类比较发生骨转移与非骨转移原发癌、及骨转移癌与其它器官转移癌中与FOXF2相关性表达的骨及骨基质重塑相关基因的平均表达水平。2.分别在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中瞬时转染含FOXF2 c DNA全长的重组真核表达质粒pc DNA3.1-HA-FOXF2(FOXF2-HA)和对照质粒(Vector)、或者在MDA-MB-231细胞中转染特异性靶向FOXF2的si RNA(small intreference RNA;si FOXF2)和对照si RNA(si Control),使乳腺癌细胞过表达外源性FOXF2或沉默内源性FOXF2表达。用成骨样骨肉瘤细胞MG-63或正常肺上皮细胞BEAS-2B的条件培养基培养癌细胞,检测乳腺癌细胞在体外模拟的骨/肺微环境中趋化迁移、异质粘附和克隆形成能力;用癌细胞的条件培养基培养小鼠成骨前体细胞MC3T3E1和破骨前体细胞,检测癌细胞诱导破骨细胞分化能力,western blot检测癌细胞中骨及骨基质重塑相关蛋白、破骨细胞分化相关因子以及被诱导的成骨细胞中与成骨细胞分化相关的分子标志物表达。3.结合文献报道,从成骨分化和骨重塑诱导因子编码基因中,筛选出BMP4为候选的FOXF2调控的下游靶基因;RT-QPCR和western blot方法检测FOXF2对乳腺癌细胞中BMP4表达水平的影响;Western blot和免疫荧光方法检测BMP信号通路下游效应分子p-Smad1(phospho-Smad1)的表达和核定位状态。4.采用BMP4生长因子诱导沉默内源性FOXF2表达的乳腺癌细胞中的BMP信号通路,或者用BMP信号通路抑制剂noggin(NOG)封闭过表达外源性FOXF2的乳腺癌细胞中的BMP信号通路,检测癌细胞在体外模拟的骨/肺微环境中趋化迁移、异质粘附和克隆形成及诱导小鼠破骨前体细胞分化能力;RT-QPCR和western blot检测癌细胞中骨及骨基质重塑相关基因m RNA和蛋白表达,从而确定BMP4对FOXF2调控的体外乳腺癌细胞骨转移潜能的介导作用。5.基于公共数据库乳腺癌组织基因表达谱数据中FOXF2和BMP4 m RNA表达水平,分析FOXF2和BMP4 m RNA水平在单纯骨转移与非骨转移的乳腺癌原发癌组织、以及骨转移癌与其它脏器转移癌组织的表达差异;Kplan Meier生存曲线和Log-rank分析FOXF2和BMP4 m RNA水平单独和联合与乳腺癌患者BMFS的关系。结果:1.在乳腺原发癌组织中,FOXF2与一组骨及骨基质重塑相关基因成正相关性表达;RT-QPCR结果证实在有远处转移的乳腺原发癌组织中FOXF2 m RNA高表达在总的(n=33,P=0.05)、Luminal亚型(n=21,P=0.06)和三阴性亚型病例中BMFS均差于低表达组(n=12,P=0.02);FOXF2 m RNA与ITGBL1和POSTN m RNA表达成正相关;公共数据库中,FOXF2 m RNA与ITGBL1、POSTN、RUNX2 m RNA表达成正相关,FOXF2 m RNA高表达的乳腺癌患者BMFS缩短;K均值聚类分析显示FOXF2联合骨及骨基质重塑相关基因m RNA高表达的乳腺癌患者易发生单纯骨转移,且其表达量在骨转移灶较高。2.过表达外源性FOXF2增强MDA-MB-231和MCF-7细胞在模拟的骨微环境中的趋化、粘附、锚定非依赖性克隆形成及诱导小鼠破骨前体细胞分化能力,而降低MDA-MB-231细胞在模拟肺微环境中的趋化和克隆形成能力,对MCF-7细胞无影响;相反,沉默内源性FOXF2表达降低MDA-MB-231细胞在模拟的骨微环境中的趋化、粘附、锚定非依赖性克隆形成及诱导小鼠破骨前体细胞分化能力,而增强在模拟的肺微环境中细胞的趋化和克隆形成能力;乳腺癌细胞中骨及骨基质重塑相关蛋白、破骨细胞分化相关因子及被诱导成骨分化标志分子在过表达外源性FOXF2的细胞中表达上调,在沉默内源性FOXF2表达的细胞中表达下调。3.在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞中,FOXF2正向调节BMP4m RNA和蛋白表达水平、以及p-Smad1水平;沉默FOXF2表达使Smad1的细胞核表达量降低。4.在沉默FOXF2表达的MDA-MB-231中施加BMP4生长因子刺激,可部分恢复沉默FOXF2表达导致的细胞在模拟的骨微环境中的趋化迁移、粘附、克隆生长及诱导小鼠破骨前体细胞分化能力,上调降低的骨基质重塑相关蛋白表达,而对模拟肺微环境趋化和克隆生长能力无明显影响;相反在过表达外源性FOXF2的乳腺癌细胞MCF-7中施加NOG阻断BMP4与其受体结合,部分减弱了由过表达外源性FOXF2导致的细胞在模拟的骨微环境中的恶性生物学行为,上调的骨及骨基质m RNA和蛋白表达下降,而对模拟肺微环境中的趋化和克隆生长能力影响无显著影响。5.FOXF2与BMP4 m RNA在乳腺原发癌组织中呈正相关性表达(n=327,P=0.01);发生单纯骨转移的乳腺癌原发癌组织(n=61)中BMP4表达水平高于其它脏器转移的非骨转移(n=307)的乳腺癌组织(P=0.05);骨转移癌组织(n=18)中BMP4表达水平高于其它器官转移癌组织(n=47,P=0.05);BMP4 m RNA高表达的乳腺癌患者BMFS低于低表达患者(n=368,P=0.045);FOXF2联合BMP4 m RNA高表达组乳腺癌患者BMFS低于其他组(n=368,P=0.022)。结论:1.FOXF2与一组骨及骨基质重塑相关基因在乳腺癌组织中呈异位共表达。FOXF2通过上调骨及骨基质重塑相关蛋白表达,使乳腺癌细胞获得骨拟态表型。2.临床病例研究、体外细胞学实验证实,FOXF2异位高表达促进乳腺癌骨转移。3.BMP4为FOXF2调控的靶基因;FOXF2上调BMP4表达,通过自分泌作用促进乳腺癌细胞高表达骨及骨基质重塑相关基因,形成骨拟态表型,进而促进其在特异性在骨微环境中的趋化迁移、定植、克隆性增殖以及促进破骨细胞分化;因而,FOXF2可能通过上调BMP4表达促进乳腺癌骨转移潜能。4.FOXF2和BMP4 m RNA在发生单纯骨转移的乳腺原发癌组织中高表达,是乳腺癌骨转移预测分子标志物,二者联合较单独应用可更好地预测乳腺癌患者骨转移风险。