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研究目的构建以HN3为单链抗体的GPC3-CAR慢病毒表达载体,将其与以GC33为单链抗体的GPC3-CAR慢病毒表达载体修饰的T细胞进行比较,检测它们对肝癌细胞杀伤的靶向性、有效性的差异,选择更优化的GPC3-CAR修饰的T细胞用于肝癌治疗,为GPC3-CAR-T的临床应用奠定基础。研究方法1.利用基因合成技术合成HN3-4-1BB-CD3ζ和HN3-CD28-4-1BB-CD3ζ基因序列(简称HBBζ、H28BBζ,课题组前期构建的以GC33为单链抗体的二代三代GPC3-CAR-T细胞简称GBBζ和G28BBζ),人工合成以HN3为单链抗体的CAR基因,制备目的质粒,用慢病毒转染的方法获得针对抗GPC3的不同单链抗体构建的CAR-T细胞,并通过流式细胞术、Western blot等方法检测GPC3-CAR在T细胞上的表达。流式检测PBMC、T细胞、HBBζ、H28BBζ、GBBζ和G28BBζ及对照组Mock细胞中CD3+CD8+T细胞与CD3+CD4+T细胞的百分比;2.通过Q-PCR、Western-blot及流式细胞术检测多种肝癌细胞中GPC-3的表达水平,筛选出不同GPC3表达水平的肝癌细胞株;针对不同GPC3表达水平肝癌细胞,应用体外细胞毒性试验检测HBBζ、H28BBζ、GBBζ和G28BBζ的杀伤效率的差异;通过酶联免疫吸附实验测定GPC3-CAR-T与肿瘤细胞共敷育后细胞因子的分泌;3.使用GPC3阳性肝癌细胞建立NCG小鼠肝癌模型,并将GPC3-CAR-T细胞注入小鼠尾静脉。通过测量皮下肿瘤体积的大小来评估CAR-T细胞在体内抑制肝癌细胞的能力。病理组织免疫组化染色用于评估CAR-T细胞的归巢能力。TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡并评价CAR-T细胞的疗效。研究结果1.采用慢病毒感染T细胞,流式检测结果表明CAR-T感染率在30%-80%,Western-blot证实靶向GPC3的嵌合抗原受体能够在T细胞上表达;流式检测CAR-T表型,发现经过体外培养之后,GPC3-CAR-T中发挥主要杀伤作用的CD8+的T细胞逐渐增多;2.通过QPCR、流式细胞术和Western-blot,证明GPC3在HepG2、Huh-7、Hep3B和两株原代肝癌细胞1214、1222均高表达,阳性率达70%-98.8%,PLC/PRF/5、SMMC7721为低表达,不表达GPC3肝癌细胞株有SK-HEP-1、QGY7701、Bel7402、97L;3.体外杀伤实验证明GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性的肝癌细胞的杀伤效率随着效靶比的增加而增加,相同代数的CAR-T细胞,以GC33为单链抗体构建的CART细胞杀伤效率更为显著,相同单链抗体构建的CAR-T细胞,三代杀伤效率更优于二代。但当靶细胞为GPC3阴性的肝癌细胞时,各组之间无明显差异(P>0.05);共培养上清在以GC33为单链抗体的CAR-T中检测到更高水平的细胞因子分泌,尤其在GPC3高表达的Hep-G2中;4.通过皮下注射GPC3阳性肝癌细胞成功建立肝癌NCG小鼠模型,GPC3-CAR-T细胞治疗组小鼠肿瘤生长速率明显更慢,肿瘤平均体积显著低于MOCK细胞组,差别具有统计学意义(P<0.05),HE染色提示GPC3-CAR-T细胞对小鼠重要脏器没有明显毒副作用,免疫组化染色提示实验组中有更多CD3+CD8+T细胞浸润肿瘤组织,明显高于对照组,TUNEL法检测到GPC3-CAR-T细胞治疗组肿瘤细胞凋亡率高于MOCK组,差别有统计学意义(P<0.05)。研究结论1.携带以HN3为单链抗体的CAR基因的慢病毒成功合成,病毒转染T细胞后,CAR蛋白能够稳定表达于T细胞表面;2.GPC3-CAR-T细胞经过体外培养后,细胞大量增殖,其中绝大部分为CD8+效应T细胞;3.在体外实验中,相同单链抗体构建的GPC3-CAR-T细胞三代杀伤效率要优于二代CAR-T细胞,相同代数的GPC3-CAR-T细胞,以GC33构建的CAR-T细胞显示出更强的杀伤能力,在体外效靶细胞共培养时,以GC33为单链抗体构建的CAR-T细胞分泌出更高水平的细胞因子;4.各组GPC3-CAR-T细胞都能抑制GPC3阳性肝癌小鼠模型的生长,但各组之间差异不明显。