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研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)在临床上较为常见,是一种以关节软骨破溃为显著病理改变的一种疾病,累计关节各个组织的骨关节疾病,包括关节软骨、滑膜、软骨下骨、周围肌肉和周围韧带,它的的主要病理特征为关节软骨破坏进行性加重,软骨下骨硬化、囊性变、骨赘形成等,临床上表现为疼痛、僵硬和功能障碍等表现为主[1]。膝关节骨性关节炎是造成中老年人群丧失劳动力的主要原因之一,经以往调查表明,接近半数的人群受其影响,极大影响人民的生活质量,带来巨大的经济负担,对社会也产生极大的社会压力,因此骨性关节炎的诊治一直是骨关节外科研究的重点。Wnt/β-catenin信号通路在骨性关节炎的发病中起着十分重要的作用,它能够激活和抑制多种蛋白和炎性因子,而这些蛋白和炎性因子在骨性关节炎中起着十分重要的作用。以往的动物研究表明,Wnt/β-catenin对骨细胞的分化有重要影响,其过度活化可导致骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,从而减少软骨细胞的数量,促进骨性关节炎的发病[2]。Wnt/β-catenin可刺激细胞内Fas基因转录,诱导细胞凋亡,同时Wnt信号通路的异常激活可在软骨细胞中表达多种蛋白酶,降解软骨基质[3]。同时,膝关节骨性关节炎患者Wnt3A、Wnt7A和BMP-2的表达增加,这与骨关节炎的发病密切相关[4]。维生素D是胆固醇的衍生物,其在体内主要活性成分有25-羟基维生素D和1,25(OH)2D3两种,前者是主要形式,但后者的活性更高,它可通过调节多种细胞因子和生长因子的信号通路影响骨代谢过程。之前的实验表明,1,25(OH)2D3可以促进成骨细胞向骨钙蛋白、骨桥蛋白转化,加速其成熟及功能,通过增加破骨细胞RANKL合成和抑制功能的合成,在成熟的成骨细胞分化过程中起着非常重要的作用[5]。维生素D对于骨性关节炎的治疗效果尚未明确,适当补充能否能够改善患者骨性关节炎的症状和缓解骨性关节炎的发病过程,以及维生素D的活性代谢物1,25(OH)2D3是通过何种途径实现这一过程,此类研究尚缺乏。既往研究表明维生素D通过干预Wnt/β-catenin信号通路在在多种癌症、肾衰、消化道疾病中等多种疾病中发挥着重要的作用。至今尚未有关于1,25(OH)2D3调控Wnt/β-catenin信号通路对关节软骨作用机制这方面的研究。目的前人的报道表明膝关节骨性关节的患者普遍缺乏维生素D,但至今尚未有关于体内25-羟基维生素D水平与患者关节滑液炎性指标之间的关系,和适当补充维生素D是否能够缓解膝关节骨性关节炎症状及延缓骨性关节炎疾病进展,以及维生素D是通过何种通路实现这一过程的研究。本研究创新性的通过研究骨性关节炎患者滑液炎性因子及临床症状与血清25-羟基维生素D之间的关系,同时应用1,25(OH)2D3干预动物模型研究其对骨性关节炎的影响,以及通过体外细胞实验研究1,25(OH)2D3调控Wnt/β-catenin信号通路对关节软骨作用机制,旨在揭示维生素(?)在骨性关节炎中的预防和治疗作用,改善临床症状,为临床防治提供更直接的实验依据。方法1本实验选用日照市人民医院骨科就诊的膝关节骨性关节炎患者作为实验组,和日照市人民医院健康查体患者,经诊断无膝关节骨性关节炎疾患的健康人作为对照组。实验组有根据放射学Kellgren-Lawrence分级分为三组:实验组A(K/L分级Ⅱ级),实验组B(K/L分级Ⅲ级),实验组C(K/L分级Ⅳ级)。分别检测各组血清25-羟基维生素D水平、膝关节液TNF-α水平、以及WOMAC评分,进行罗盖全(1,25(OH)2D3)干预治疗4周,再次检测各组血清25-羟基维生素D水平、膝关节液TNF-α水平、以及WOMAC评分。分析通过口服1,25(OH)2D3对骨性关节炎患者临床症状之间的关系。2选取大小、体质量相似雄性SD大鼠用关节不稳的方法来建立大鼠骨关节炎模型(切断内侧副韧带并摘除内侧半月板)。另取12只SD大鼠,依照前法建立关节不稳术模型,随机将关节不稳术后大鼠分成实验组A和实验组B,实验组A每日使用罗盖全(1,25(OH)2D30.1ug*kg-1)给老鼠灌胃干预,实验组B给予同体积花生油灌胃。术后4周对各组进行LequesneMG评分,另取膝关节标本,对大鼠膝关节软骨进行大体观察。分析通过口服1,25(OH)2D3对骨性关节炎的病程进展之间的关系。3分离培养大鼠膝关节软骨细胞,对细胞的形态学进行观察,同时采用免疫组化法检测软骨细胞标志物Ⅱ型胶原蛋白和转录因子SOX9的表达。用不同浓度TNF-α(5、10、25、50、75和100ng/ml)分别处理软骨细胞24、48和72小时,然后使用CCK-8法测定细胞增殖,确定TNF-α抑制软骨细胞增殖的最佳浓度。将培养的大鼠软骨细胞作为实验细胞来源,分为空白组和实验组。实验组包括:TNF-α 组,TNF-α+1,25(OH)2D3(10nM),TNF-α+1,25(OH)2D3(100nM),TNF-α+β-catenin 抑制剂(5μM IWR-1-endo)。按各组分别处理软骨细胞后,采用CCK8检测细胞增殖,流式细胞仪检测凋亡,比色法检测 Caspase3 活性,Real-time PCR 和 Western blot 检测 β-catenin、COL-Ⅱ、SOST、MMP13 的表达。结果1对照组:血清25-羟基维生素D水平27.13±4.51ng/ml,关节液TNF-α 水平 268.27±54.76pg/ml。实验组 A(K/L 分级 Ⅱ 级):血清 25-羟基维生素D水平22.33±4.81ng/ml,关节液TNF-α水平388.72±50.65pg/ml,WOMAC评分24.83±6.30分,罗盖全(1,25(OH)2D3)干预治疗后,患者血清25-羟基维生素D水平28.26±2.99ng/ml,关节液TNF-α水平 273.78±37.35pg/m1,WOMAC 评分 15.17±3.87 分。实验组 B(K/L 分级Ⅲ级):血清25-羟基维生素D水平19.12±4.61ng/ml,关节液TNF-α水平 483.09±54.92pg/ml,WOMAC 评分 52.00±6.80 分,罗盖全(1,25(OH)2D3)干预治疗后,患者血清25-羟基维生素D水平27.78±5.11ng/ml,关节液TNF-α水平 398.59±58.75pg/ml,WOMAC评分44.13±7.49分。实验组C(K/L分级Ⅳ级):血清25-羟基维生素D水平11.93±3.23ng/ml,关节液 TNF-α 水平 600.50±66.81pg/ml,WOMAC 评分 85.50±5.36 分,罗盖全(1,25(OH)2D3)干预治疗后,患者血清25-羟基维生素D水平23.46±4.92ng/ml,关节液TNF-α水平460.85±38.16pg/ml,WOMAC评分82.17±5.71分。我们发现膝关节骨性关节炎患者普遍存在着维生素D缺乏与不足,且缺乏的程度与膝关节骨性关节炎的严重程度正相关。膝关节骨性关节炎患者关节滑液中TNF-α水平比健康人明显增加,且患者膝关节滑液TNF-α水平与膝关节骨性关节炎的严重程度正相关。膝关节骨性关节炎患者补充维生素D可以降低膝关节滑液TNF-α水平,并且可以降低患者临床评分,改善患者的临床症状。2将大鼠进行内侧副韧带切断,并切除内侧半月板,建立关节不稳,术后6周解剖见大鼠股骨内髁明显软骨糜烂、溃疡,大量骨赘生成,内侧胫骨平台关节面磨损严重,软骨溃疡,证明膝关节骨性关节炎模型制作成功。另取12只SD大鼠,依照前法建立关节不稳术模型,随机将关节不稳术后大鼠分成实验组A和实验组B,实验组A每日使用罗盖全(1,25(OH)2D30.1ug·kg-1)给老鼠灌胃干预,实验组B给予同体积花生油灌胃,术后4周观察:实验组A及实验B的LequesneMG评分评分显著增高,实验组A与实验组B相比LequesneMG评分评分下降,有统计学差异(p<0.05)。通过对实验组A和实验组B膝关节标本的大体观察发现:实验组A:股骨内髁关节面少部分糜烂溃疡,内存胫骨平台可见轻度关节软骨磨损,少量溃疡,可见骨质增生及骨赘生产。实验组B:股骨内髁明显软骨糜烂、溃疡,大量骨赘生成,内侧胫骨平台关节面磨损严重,软骨溃疡。3在显微镜下观察,可以看见大量三角形和梭形的大鼠膝软骨细胞,形态不规则,细胞生长良好,可见假足相互连接,细胞内充满细胞质,透明核位于中心,呈圆形核大,细胞越大,核越清晰。原代大鼠软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白和转录因子SOX9的免疫组化染色显示,收集到的细胞强烈表达软骨生成标记物Ⅱ型胶原蛋白和转录因子SOX9(P<0.01),提示软骨细胞培养成功。分别用不同浓度的TNF-α处理软骨细胞,其抑制软骨细胞增殖呈剂量依赖性,特别是与对照组比较,TNF-α抑制软骨细胞增殖的最佳浓度为50ng/ml。同时发现1,25(OH)2D3显著抑制TNF-α介导的软骨细胞增殖下降及软骨细胞凋亡作用(P<0.01)。同时1,25(OH)2D3(10和100 nM)处理显著抑制了 TNF-α介导的Caspase-3活性增加,抑制率分别为16.1%和45.8%(P<0.01)。我们还通过实时 PCR 和 Western blot 测定了 TNF-α 诱导的软骨细胞中SOST、β-catenin、COL-Ⅱ和MMP13的表达。结果显示,与对照相比,50ng/ml TNF-α处理可显著增加β-catenin和MMP13的表达,但降低了 SOST 和 COL-Ⅱ 的表达(P<0.01)。而 1,25(OH)2D3或 IWR-1-endo(5mM)处理则显著抑制软骨细胞中TNF-α介导的SOST、β-catenin、COL-Ⅱ和 MMP13 表达(P<0.01)。结论本文弥补了维生素D缓解膝关节骨性关节炎症状及延缓骨性关节炎病程进展,以及1,25(OH)办调控Wnt/β-catenin信号通路对关节软骨作用机制的研究空白。得出结论:VitD其活性成分1,25(OH)2D3阻断Wnt/β-catenin信号通路来对关节软骨细胞产生保护机制,从而延缓关节软骨退变,对骨性关节炎的预防和治疗提供理论依据。