目的：用分子克隆技术构建3种慢病毒载体，并用以它们为媒介制备的基因修饰的K562细胞系作为饲养层细胞，在体外扩增出高细胞毒活性的NK-92细胞，为后续CAR-NK-92细胞的体外扩增提供实验依据。
　　方法：在慢病毒载体pWPI含有报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein， GFP)的基础上，分别插入目的基因白细胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)、白细胞介素-21(Interleukin-21，IL-21)和4-1BB配体(4-1BB ligand，4-1BBL)，构建出3种慢病毒表达载体。慢病毒包膜蛋白质粒VSV-G、包装质粒psPAX2、慢病毒表达载体4-1BBL分别和慢病毒表达载体IL-15、IL-21共转染HEK293FT细胞，浓缩2种细胞培养上清液，得到慢病毒液，并用慢病毒液感染K562细胞。利用显微注射技术挑选并扩大培养得到能够稳定表达GFP基因的K562细胞，经丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)处理后作为饲养层细胞，体外扩增NK-92细胞。通过CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)检测体外扩增后NK-92细胞毒性，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放法检测NK-92细胞活性，酶联免疫分析(ELISA)检测NK-92细胞上清中γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的水平，验证扩增后NK-92细胞的功能及安全性。
　　结果：酶切鉴定和测序结果证明3种慢病毒载体构建成功；通过荧光显微镜观察到2组慢病毒表达载体转染HEK293FT细胞以及慢病毒液感染K562细胞后GFP的表达；流式结果显示两组细胞中，4-1BBL的阳性表达率均较高；终浓度为10μg/ml的MMC溶液处理K562细胞3h可以得到良好的饲养层细胞；IL-15组K562细胞作为饲养层细胞扩增出更多数量的NK-92细胞；CCK-8结果显示随着效靶比的逐渐增加，IL-15组作为饲养层细胞扩增后的NK-92细胞毒性高于其余各组(P＜0.05)；效靶比为10∶1时，IL-15组细胞上清中LDH的活性、IFN-γ的含量有所升高(P＜0.05)。
　　结论：构建含有报告基因GFP和目的基因IL-15、IL-21、4-1BBL的慢病毒载体与慢病毒包装载体制备的慢病毒液感染K562细胞后，表达绿色荧光蛋白和目的基因IL-21/4-1BBL的K562细胞系构建成功。IL-15和4-1BBL联用制备出的K562细胞作为饲养层可体外扩增出高细胞毒活性和有效抗肿瘤细胞A549细胞活性的NK-92细胞。